Condensats de protéines induits par dimérisation chimique sur les télomères

Résumé

Ce protocole illustre un système de dimérisation des protéines induit chimiquement pour créer des condensats sur la chromatine.  La formation d’un corps nucléaire de leucémie promyélocytaire (LEMP) sur des télomères avec des dimériseurs chimiques est démontrée. La croissance, la dissolution, la localisation et la composition des gouttelettes sont surveillées par imagerie cellulaire vivante, immunofluorescence (IF) et hybridation in situ par fluorescence (FISH).

Résumé

Les condensats associés à la chromatine sont impliqués dans de nombreux processus nucléaires, mais les mécanismes sous-jacents restent insaisissables. Ce protocole décrit un système de dimérisation des protéines induit chimiquement pour créer des condensats sur les télomères. Le dimériseur chimique se compose de deux ligands liés qui peuvent chacun se lier à une protéine: le ligand Halo à Halo-enzyme et le triméthoprime (TMP) à E. coli dihydrofolate réductase (eDHFR), respectivement. La fusion de l’enzyme Halo à une protéine télomère ancre les dimériseurs aux télomères par liaison covalente ligand-enzyme Halo. La liaison du TMP à l’eDHFR recrute la phase fusionnée de l’eDHFR séparant les protéines en télomères et induit la formation de condensats. Étant donné que l’interaction TMP-eDHFR n’est pas covalente, la condensation peut être inversée en utilisant un excès de TMP libre pour concurrencer le dimériseur pour la liaison eDHFR. Un exemple d’induction de la formation du corps nucléaire de la leucémie promyélocytaire (LEMP) sur les télomères et de détermination de la croissance, de la dissolution, de la localisation et de la composition des condensats est montré. Cette méthode peut être facilement adaptée pour induire des condensats à d’autres endroits génomiques en fusionnant Halo à une protéine qui se lie directement à la chromatine locale ou à dCas9 qui cible le locus génomique avec un ARN guide. En offrant la résolution temporelle requise pour l’imagerie en direct unicellulaire tout en maintenant la séparation de phase dans une population de cellules pour les essais biochimiques, cette méthode convient pour sonder à la fois la formation et la fonction des condensats associés à la chromatine.

Introduction

De nombreuses protéines et acides nucléiques subissent une séparation de phase liquide-liquide (LLPS) et s’auto-assemblent en condensats biomoléculaires pour organiser la biochimie dans les cellules^1,2. Le LLPS des protéines de liaison à la chromatine conduit à la formation de condensats associés à des loci génomiques spécifiques et impliqués dans diverses fonctions locales de la chromatine³. Par exemple, LLPS de la protéine HP1 sous-tend la formation de domaines hétérochromatiques pour organiser le génome^4,5,LLPS des facteurs d....

Protocole

1. Production de lignées cellulaires transitoires

1. Culture de cellules acceptrices U2OS sur des couvercles en verre de 22 x 22 mm (pour l’imagerie vivante) ou des couvercles circulaires de 12 mm de diamètre (pour IF ou FISH) recouverts de poly-D-lysine dans une plaque à 6 puits avec milieu de croissance (10% de sérum bovin fœtal et 1% de solution de pénicilline-streptomycine dans DMEM) jusqu’à ce qu’ils atteignent 60-70% de confluence.
2. Remplacer le milieu de croissance par un milieu de transfection de 1 mL (milieu de croissance sans solution de pénicilline-streptomycine) avant la transfection.
3. Pour chaque puits de transfec....

Résultats

Des images représentatives de la localisation télomérique de SUMO identifiées par l’ADN télomère FISH et la protéine SUMO IF sont montrées à la figure 2. Les cellules à recrutement SIM enrichissent SUMO1 et SUMO 2/3 sur télomères par rapport aux cellules à recrutement mutant SIM. Cela indique que l’enrichissement SUMO induit par la dimérisation SIM sur les télomères dépend des interactions SUMO-SIM.

Un film en accéléré représentatif de TRF.......

Discussion

Ce protocole a démontré la formation et la dissolution de condensats sur des télomères avec un système de dimérisation chimique. La cinétique de la séparation de phase et du regroupement des télomères induit par la fusion de gouttelettes est surveillée par imagerie en direct. La localisation et la composition des condensats sont déterminées avec l’ADN FISH et la protéine IF.

Ce protocole présente deux étapes critiques. La première consiste à déterminer la concentration en .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	MT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906	Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture Plate	VWR	10861-554
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-101
Anti-mCherry antibody	Abcam	Ab183628
Anti-PML antibody	Santa Cruz	sc966
Anti-SUMO1 antibody	Abcam	Ab32058
Anti-SUMO2/3 antibody	Cytoskeleton	Asm23
Blocking Reagent	Roche	11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9706100
BTX Tube micro 1.5ML	VWR	89511-258
Circle Cover Slips	Thermo Scientific	3350
Confocal microscope	Nikon	MQS31000
DAPI	Fisher Scientific	D1306
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10017CV
EMCCD Camera	iXon Life	897
Ethanol	Fisher Scientific	4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions	Gibco	A4766801
Formamide, Deionized	MilliporeSigma	46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Laser merge module	Nikon	NIIMHF47180
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668027
Figure plotting software, MATLAB	The MathWorks
Microscope Slide Box	Fisher Scientific	34487
Nail Polish	Fisher Scientific	50-949-071
Imaging software, NIS-Elements	Nikon
Opti-MEM Reduced Serum Media	Gibco	51985091
Parafilm	Bemis	13-374-12
PBS 10x, pH 7.4	Fisher Scientific	70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100X	Gibco	15140122
Piezo Z-Drive	Physik Instrumente (PI)	91985
Pipet Tips	VWR	10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides	Fisher Scientific	22-037-246
Poly-D-Lysine solution	Sigma-Aldrich	A-003-E
Sodium Azide	Fisher Scientific	BP922I-500
Spinning disk	Yokogawa	CSU-X1
Square Cover Slips	Thermo Scientific	3305
TBS 10x solution	Fisher Scientific	BP2471500
TelC-Alexa488	PNA Bio	F1004
TMP	Synthesized by Chenoweth lab		Available upon request
TNH	Synthesized by Chenoweth lab		Available upon request
Tris Solution	Fisher Scientific	92-901-00ML
Triton X-100 10% Solution	MilliporeSigma	64-846-350ML	Prepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell line	From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)	HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	NC9524612