Établir un système de culture de sphéroïdes épidermiques à haut débit pour modéliser la plasticité des cellules souches kératinocytes

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour la culture systématique de sphéroïdes épidermiques en culture en suspension 3D. Ce protocole a de nombreuses applications pour une utilisation dans une variété de types de tissus épithéliaux et pour la modélisation de plusieurs maladies et affections humaines.

Résumé

La dérégulation épithéliale est un nœud pour une variété de conditions et de maux humains, y compris les blessures chroniques, l’inflammation et plus de 80% de tous les cancers humains. En tant que tissu de la muqueuse, l’épithélium cutané est souvent sujet à des blessures et s’est adapté à l’évolution en acquérant la plasticité cellulaire nécessaire pour réparer les tissus endommagés. Au fil des ans, plusieurs efforts ont été déployés pour étudier la plasticité épithéliale à l’aide de modèles cellulaires in vitro et ex vivo. Cependant, ces efforts ont été limités dans leur capacité à récapituler les différentes phases de la plasticité des cellules épithéliales. Nous décrivons ici un protocole pour générer des sphéroïdes épidermiques 3D et des cellules dérivées de sphéroïdes épidermiques à partir de kératinocytes humains néonatals primaires. Ce protocole décrit la capacité des cultures de sphéroïdes épidermiques à modéliser fonctionnellement des stades distincts de la plasticité générative des kératinocytes et démontre que le repoingage des sphéroïdes épidermiques peut enrichir les cultures hétérogéniques normales de kératinocytes humains (NHKc) pour les sous-populations de kératinocytes intégriens (NHKc) pour les sous-populations de kératinocytes^{intégriens hi}/EGFR^lo présentant des caractéristiques améliorées semblables à celles de la tige. Notre rapport décrit le développement et le maintien d’un système à haut débit pour l’étude de la plasticité kératinocytaire cutanée et de la régénération épidermique.

Introduction

L’épithélium stratifié des mammifères est l’architecture épithéliale la plus complexe de tous les systèmes vivants et est le plus souvent sujet à des dommages et à des blessures. En tant que tissu protecteur, l’épithélium stratifié a évolué pour générer une réponse complexe et efficace aux lésions tissulaires. En cas de blessure, ces cellules doivent activer des programmes de plasticité de lignée, qui leur permettent de migrer vers le site blessé et d’effectuer des réparations^1,2,3. Cette réponse multiforme se produit en plusieurs étapes séquentielles qui restent mal comprise....

Protocole

Le protocole de prélèvement et de manipulation des échantillons de peau et d’isolement des kératinocytes humains a été examiné par l’IRB de l’Université de Caroline du Sud (UofSC) et classé comme « recherche n’impliquant pas de sujets humains », car les échantillons de prépuce étaient des rejets chirurgicaux produits lors d’interventions chirurgicales de routine (circoncision des nouveau-nés) et étaient complètement dépourvus d’informations d’identification. Le protocole a également été examiné et approuvé régulièrement par le Comité de la biosécurité de l’Université de la Sécurité, et tout le personnel de laboratoire a suivi une formation en matière de biosécurité en....

Résultats

Au cours du dosage de l’épidermosphère cutanée, les cultures de NHKc sont ensemenc dans des puits recouverts d’agarose d’une plaque de 96 puits(figure 1A). Les cellules formant des sphéroïdes devraient s’auto-agréger dans les 48h. La formation autonome de sphéroïdes peut être évaluée dès 24 heures à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé standard. la formation de l’épidermosphère cutanée et le modèle de test de re-placage de différentes phases d.......

Discussion

L’utilisation de systèmes de culture sphéroïde 3D a eu une grande utilité dans l’évaluation de la souche cellulaire. Il a été démontré que ces systèmes améliorent l’enrichissement des cellules souches tissulaires¹³, mais leur utilité pour l’étude des cellules souches épidermiques humaines a été peu explorée. Nous décrivons ici une stratégie d’enrichissement des cellules souches kératinocytes humaines à l’aide de techniques de culture 3D. Dans ce système, les NHKc .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affymetrix platform	Affymetrix		For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file	Affymetrix		Process
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent		For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204	Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466			analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer	Beckman		For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For confirming data quality
Cytokeratin 14	Santa Cruz Biotechnology	sc-53253	1:200 dilution
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818	For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6	Abcam	ab30496	For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640	Thermo Fisher Scientific		For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit	Affymetrix/Thermo Fisher Scientific		For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2)	Cell Signaling Technology	8910	For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF)	Cell Signaling Technology	8916	For cell media
Human Insulin	Millipore Sigma	9011-M	For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)	Bio-Rad	1708880	Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890	Used for RT-qPCR
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005041	Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm	ThermoFisher Scientific	17005042	Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium	Sigma-Aldrich	M7403	MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS	Stellar Scientific	NST230111	For immunostaining
P63	Thermo Scientific	703809	1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number )	BD Pharmingen	555997	For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector	Addgene	20672	For transfection
Promega TransFast kit	Promega	E2431	For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen		For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units	Thermo Scientific	09-740-63D	For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope	Zeiss		Use with Axiovision Rel. 4.5 software