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Résumé

Nous présentons un protocole pour la préparation de lamelles d’échantillons biologiques congelés par micro-usinage par faisceau d’ions cryo-focalisé pour des études structurelles à haute résolution de macromolécules in situ avec cryo-tomographie électronique. Le protocole présenté fournit des lignes directrices pour la préparation de lamelles de haute qualité avec une reproductibilité élevée pour la caractérisation structurelle des macromolécules à l’intérieur des Saccharomyces cerevisiae.

Résumé

Aujourd’hui, la cryo-tomographie électronique (cryo-ET) est la seule technique qui peut fournir des données structurelles à résolution quasi atomique sur des complexes macromoléculaires in situ. En raison de la forte interaction d’un électron avec la matière, les études cryo-ET à haute résolution sont limitées aux échantillons d’une épaisseur inférieure à 200 nm, ce qui limite l’applicabilité de la cryo-ET uniquement aux régions périphériques d’une cellule. Un flux de travail complexe qui comprend la préparation de sections transversales cellulaires minces par micro-usinage par faisceau d’ions cryo-focalisé (cryo-FIBM) a été introduit au cours de la dernière décennie pour permettre l’acquisition de données cryo-ET à partir de l’intérieur de cellules plus grandes. Nous présentons un protocole pour la préparation de lamelles cellulaires à partir d’un échantillon vitrifié par congélation plongeante en utilisant Saccharomyces cerevisiae comme exemple prototypique d’une cellule eucaryote largement utilisée dans la recherche en biologie cellulaire et moléculaire. Nous décrivons des protocoles pour la vitrification de S. cerevisiae en plaques isolées de quelques cellules ou d’une monocouche continue des cellules sur une grille TEM et fournissons un protocole pour la préparation de lamelles par cryo-FIB pour ces deux échantillons.

Introduction

Les récents développements technologiques et logiciels ont fait de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) des spécimens biologiques vitrifiés l’une des techniques clés de la recherche en biologie structurale au cours de la dernière décennie1,2. La préparation d’un échantillon pour cryo-EM consiste généralement en l’application d’une protéine purifiée ou d’un complexe de protéines avec de l’acide nucléique sur le support de l’échantillon (grille TEM), suivie de l’élimination de la majeure partie du liquide avec un papier filtre, et de la congélation plongeante de la grille avec la couche mince résiduelle d’un échantillon dans de l’éthane liquide ou du propane3 . L’échantillon est ainsi fixé dans une fine couche (généralement <80 nm) de tampon amorphe à l’état entièrement hydraté, dans des conditions quasi natives, et sans qu’il soit nécessaire de fixer chimiquement ou de contraster les métaux lourds. L’imagerie de l’échantillon structurellement homogène au microscope électronique à transmission donne alors des données qui peuvent être utilisées pour la détermination de la structure tridimensionnelle de la macromolécule à une résolution quasi atomique à l’aide d’un seul protocole d’analyse departicules 2. Une telle structure in vitro correspond à la représentation de la macromolécule dans les conditions et le traitement utilisés lors de la préparation de l’échantillon. Bien que les structures déterminées dans les conditions in vitro correspondent généralement à l’état pleinement fonctionnel de la macromolécule, la capacité d’imager les relations spatiales entre diverses macromolécules à l’intérieur de la cellule fournirait un contexte fonctionnel supplémentaire aux données structurelles.

La cryo-tomographie électronique (cryo-ET) est utilisée pour reconstruire des volumes 3D d’objets pléomorphes ou de complexes macromoléculaires in situ4,5. L’avantage du cryo-ET est que l’information tridimensionnelle est obtenue en imageant une seule entité. Cependant, la résolution à laquelle des complexes macromoléculaires individuels ou des organites sont observés est très limitée. Par conséquent, la moyenne des macromolécules (moyenne des sous-tomogrammes, STA) avec la même structure à partir d’un plus grand nombre de tomogrammes est nécessaire pour atteindre des modèles de résolution 4-8 Å à partir des données cryo-ET6,7. Il a récemment été démontré que cryo-ET et STA peuvent également être appliqués pour déterminer des structures à haute résolution de machines macromoléculaires telles que les ribosomes dans le contexte de l’environnement cellulaire7. Cependant, l’utilisation de la microscopie électronique à transmission est limitée par l’épaisseur de l’échantillon. En général, ce n’est pas un problème pour la cryo-EM à particule unique où l’optimisation des conditions de vitrification peut éventuellement entraîner l’incorporation de l’échantillon dans une fine couche de glace. D’autre part, la plupart des cellules ne sont en fait pas transparentes en électrons pour le faisceau d’électrons de 300 keV. Le chemin libre moyen inélastique dans les échantillons biologiques vitrifiés pour les électrons de 300 keV est d’environ 395 nm8, ce qui signifie que les études cryo-ET sont limitées à la périphérie cellulaire pour la plupart des cellules.

Différentes techniques ont été développées pour éclaircir l’échantillon jusqu’à une épaisseur suffisante pour la cryo-ET. La cryo-ultramicrotomie utilise le tranchage mécanique de l’échantillon avec un couteau diamanté à la température de l’azote liquide (-196 °C) pour fournir des sections d’épaisseur de 60 à 80 nm adaptées à la cryo-ET9,10,11. Plusieurs sections peuvent être préparées à partir d’une seule cellule et l’analyse des données peut éventuellement produire des informations structurelles 3D pour la plus grande partie de la cellule. Cependant, le tranchage mécanique peut provoquer plusieurs artefacts tels que des sections courbes, des crevasses ou une compression d’échantillon, ce qui peut influencer la structure résultante et biaiser les données cryo-ET10,11,12. Le micro-usinage par faisceau d’ions cryoconsoités (cryo-FIBM) représente une approche alternative où une section cellulaire mince est préparée par ablation progressive de l’échantillon à l’aide d’un faisceau focalisé d’ions Ga+ (FIB) dans un processus en plusieurs étapes, ce qui peut entraîner une section cellulaire (lamelles) de 80 à 300 nm d’épaisseur13,14,15 . Contrairement à la cryo-ultramicrotomie, une seule lamelle est préparée à partir d’une seule cellule, ce qui représente environ 0,3 à 3% de son volume, et le micro-usinage de plusieurs cellules est généralement nécessaire pour trouver une région d’intérêt dans la section transversale fraisée. En outre, le débit de l’ensemble du flux de travail est encore assez faible, souvent limité à 6 à 8 lamelles de haute qualité provenant d’une session cryo-FIBM de 8 heures. D’autre part, les sections transversales cryo-FIBM sont dépourvues de tout artefact de compression et fournissent une entrée appropriée pour la cryo-ET haute résolution. De plus, le transfert de la lamelle au support de l’échantillon pour la cryo-ET n’est pas nécessaire car l’échantillon est conservé sur la grille TEM pendant tout le processus de préparation de la lamelle et la même grille peut ensuite être transférée à TEM. Nous nous attendons à ce que le débit du cryo-FIBM soit bientôt considérablement amélioré, principalement grâce à la disponibilité de logiciels pour le fraisage non supervisé des lamelles16,17 et à l’utilisation de FIB fonctionnant sur le principe du plasma à couple de charge, ce qui permettra une ablation plus rapide du matériau.

Saccharomyces cerevisiae (levure) sont des cellules eucaryotes de forme sphérique et de diamètre d’environ 2-5 μm. Grâce à sa taille, son accessibilité, sa génétique, son temps de génération et sa manipulation simple, la levure est largement étudiée en tant qu’organisme modèle eucaryote dans la recherche en biologie cellulaire et moléculaire similaire à Escherichia coli, qui est bien étudiée en tant qu’organisme modèle procaryote en bactériologie. La levure peut être facilement cultivée en suspension et une grande quantité de cellules est générée en peu de temps (temps double de 1 à 2 heures). Plus important encore, la levure partage une structure cellulaire interne complexe avec les cellules animales et végétales tout en conservant un petit génome composé d’une faible teneur en ADN non codant. La caractérisation structurale du protéome de levure à partir des données in situ à haute résolution peut donc aider à fournir une description mécaniste de la grande quantité de données fonctionnelles disponibles dans la littérature.

Ici, nous fournissons un protocole complet pour l’acquisition de données cryo-ET in situ sur l’échantillon de levure, qui couvre toutes les étapes de la culture de l’échantillon jusqu’à la préparation de la lame cryo-FIBM, et le transfert de l’échantillon à TEM pour l’acquisition de données cryo-ET.

Protocole

1. Culture et préparation des cellules de Saccharomyces cerevisiae pour la vitrification

  1. Préparer un milieu de croissance liquide pour Saccharomyces cerevisiae.
    1. Autoclavez une bouteille en verre de 500 mL pour la préparation du milieu de croissance.
    2. Peser 2,2 g d’extrait de levure (1,1 %) et 4,4 g de peptone (2,2 %) et mélanger dans 200 mL d’eau.
    3. Stériliser par autoclavage pendant 15 min à 121 °C.
    4. Peser 10 g de poudre de glucose et mélanger dans 50 mL d’eau pour obtenir une solution de glucose à 20%. Faire passer la solution à travers un filtre de 0,2 μm et la conserver à 4 °C.
  2. Préparer un milieu solide pour Saccharomyces cerevisiae.
    1. Peser 4 g de poudre d’agar et mélanger avec 200 mL de milieu de croissance.
    2. Stériliser dans un autoclave pendant 15 min à 121 °C.
    3. Refroidir le milieu à 40-50 °C et ajouter 20 mL de glucose stérile à 20 % (préparé à l’étape précédente). Versez environ 20 mL du milieu complet dans la boîte de Pétri et laissez-la se solidifier à température ambiante.
    4. Envelopper les plaques d’agar dans un parafilm à l’abri du séchage et conserver à 4 °C.
  3. Culture Saccharomyces cerevisiae en suspension
    REMARQUE: Le protocole est optimisé pour la préparation d’un échantillon pour cryo-FIBM à partir d’une suspension de la lignée cellulaire Saccharomyces cerevisiae souche BY4741 [ATCC 4040002] ou de souches similaires.
    1. Autoclavez une fiole d’Erlenmeyer (ou similaire) de 50 mL.
    2. Travaillez dans une hotte ou une boîte à flux laminaire. Pipeter 10 mL du milieu de croissance jusqu’à une fiole stérile de 50 mL d’Erlenmeyer.
    3. Complétez le milieu avec 1 mL de glucose filtré à 20%. Choisissez une colonie de levure dans une plaque de gélose avec une boucle d’inoculation stérile et jetable (1-10 μL).
    4. Placer la fiole d’Erlenmeyer dans l’incubateur et la culture à 30 °C avec agitation (150-200 tr/min) jusqu’à ce que la phase exponentielle soit atteinte (environ 7 h).
      REMARQUE: Nous avons observé que la phase exponentielle est atteinte après ~ 15 h lorsque les colonies sont prélevées sur des plaques de gélose qui ont été cultivées à température ambiante pendant 4 semaines. Voir aussi la note ci-dessous.
  4. Culture Saccharomyces cerevisiae sur une plaque de gélose à partir de glycérol.
    1. Utilisez une nouvelle plaque de gélose du stockage à 4 °C.
    2. Prenez le stock de S. cerevisiae du congélateur à -80 °C et placez-le dans un support de congélation pour éviter une décongélation complète du stock.
    3. Gratter et transférer une petite culture avec une boucle d’inoculation stérile (1-10 μL) à 50 μL de milieu de croissance. Mélanger correctement.
    4. Transférer tout le volume de culture mélangée de S. cerevisiae et disperser avec un bâton d’étalement stérile sur la surface de la plaque de gélose.
    5. Incuber à 30 °C pendant environ 48 heures jusqu’à ce que des colonies de 1,5 à 2 mm de diamètre se forment.
      REMARQUE: Il est conseillé de faire la culture des colonies fraîchement avant l’expérience. Les colonies âgées de plus de 1 semaine auront besoin d’une période prolongée pour la culture en milieu liquide afin d’atteindre la phase de croissance exponentielle.
  5. Culture Saccharomyces cerevisiae sur une plaque de gélose.
    1. Utilisez des plaques de gélose préparées avec des colonies de S. cerevisiae cultivées.
    2. Pipette 10 mL de milieu de croissance stérile et 1 mL de glucose filtré à 20 % dans une fiole d’Erlenmeyer de 50 mL.
    3. Choisissez une colonie de culture de S. cerevisiae avec une boucle d’inoculation stérile et mélangez-la avec un milieu de croissance dans une fiole.
    4. Incuber 50 minutes à 30 °C avec agitation (150-200 tr/min).
    5. Diluer la culture en suspension dix fois avec le milieu de croissance et disperser 50 μL de suspension sur une plaque d’agar avec un bâton d’étalement stérile.
    6. Incuber à 30 °C pendant environ 48 heures jusqu’à ce que des colonies de 1,5 à 2 mm soient observées.
    7. Enveloppez les bords de la boîte de Petri avec un parafilm pour l’empêcher de sécher. Conserver à température ambiante et utiliser pendant un maximum de 4 semaines.
  6. Préparer Saccharomyces cerevisiae pour la congélation plongeante dans des amas de cellules.
    1. Préparer la culture cellulaire de S. cerevisiae conformément au protocole de la section Culture de Saccharomyces cerevisiae en suspension (section 1.3) et incuber ~7 h à 30 °C avec agitation (150-200 tr/min).
    2. Mesurer la DO de la culture en suspension cellulaire de S. cerevisiae à 600 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV/Vis.
    3. Concentrer la suspension cellulaire sur OD600 = 1.
  7. Préparer S. cerevisiae à la congélation plongeante dans une monocouche cellulaire.
    1. Préparer la culture cellulaire de S. cerevisiae selon le protocole de la section Culture de cellules en suspension de Saccharomyces cerevisiae et incuber ~7 h à 30 °C avec agitation (150-200 tr/min).
    2. Mesurer la DO de la culture en suspension cellulaire de S. cerevisiae à 600 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV/Vis.
    3. Transférer les cellules en milieu dans le tube de centrifugeuse et tourner doucement pendant 2 minutes à une force centrifuge relative (900 x g).
    4. Jeter le milieu de la pastille de la cellule par pipetage.
    5. Ajouter un milieu frais à la pastille cellulaire. Calculez le volume de milieu pour obtenir une suspension cellulaire de OD600 égale à 30 à 60.
    6. Ajouter le glycérol (solution d’origine à 50%) à la suspension cellulaire à une concentration finale de 5% peu de temps avant la vitrification.
      REMARQUE: Le glycérol agit comme un agent protecteur, ce qui améliore la qualité de la glace dans les régions entre les cellules. Le glycérol n’est ajouté aux cellules que peu de temps avant la vitrification pour minimiser son absorption dans la cellule.

2. Vitrification de l’échantillon de Saccharomyces cerevisiae

  1. Grilles TEM à décharge incandescente avec le côté film de carbone tourné vers le haut pendant 30-45 s (pression: 6-9 Pa, courant: 7 mA).
  2. Réglez le robot de vitrification sur les paramètres suivants: température: 18 °C, humidité: 100%, temps de transfert: 6 s, temps d’attente: 5 s, cycle de buvard: 1x et force de transfert: 5.
    REMARQUE: La force de transfert est une valeur spécifique à l’instrument et les valeurs de force de transfert optimales peuvent différer d’une machine à l’autre. La valeur optimale pour un piston particulier doit être confirmée expérimentalement.
  3. Préparer l’éthane liquide pour la vitrification.
  4. Montez le tampon de surface non absorbant sur le tampon de buvard faisant face à l’échantillon. Utilisez le papier filtre pour l’autre tampon de buvard.
  5. Choisissez la grille déchargée de lueur avec la pince à épilation et montez la pince à épileuse sur l’instrument de congélation à piston.
  6. Appliquer 3,5 μL de suspension de S. cerevisiae sur le côté carbone de la grille à l’intérieur de la chambre climatique du piston. Mélangez correctement avant chaque application sur la grille.
  7. Plongez congeler la grille dans l’éthane liquide.
  8. Transférer la grille de l’éthane liquide vers LN2. Stockez les grilles avec des cellules vitrifiées dans des conditions LN2 ou montez-les dans la cartouche de grille TEM pour les charger dans le microscope FIB-SEM.

3. Montage des grilles TEM dans la cartouche de grille

REMARQUE: Le flux de travail décrit ici utilise les grilles TEM montées dans la cartouche de grille pour faciliter la manipulation et le transfert des échantillons entre les microscopes SEM et TEM. L’ensemble de la cartouche se compose d’un anneau C, d’une grille TEM et d’un anneau C-clip. D’autres options sont disponibles lorsque vous travaillez avec des instruments d’autres fabricants de microscopes. La station de travail d’assemblage de cartouches de grille est remplie de LN2. Le niveau LN2 recouvre la boîte de grille avec les grilles TEM, mais le montage des grilles TEM dans la cartouche est effectué en vapeurs LN2. Il est fortement recommandé de porter un masque ou un bouclier protecteur pendant la procédure de vitrification pour éviter que la contamination ne respire jusqu’à l’échantillon. Ne travaillez pas avec les outils qui ont accumulé la contamination de la glace.

  1. Assemblez le poste de travail d’assemblage des cartouches de grille et préparez les outils secs pour le découpage.
  2. Refroidissez le poste de travail d’assemblage avec LN2. Refroidissez les outils d’écrêtage à la température LN2.
  3. Placez une boîte de grille avec un échantillon vitrifié dans le poste de travail d’assemblage.
  4. Placez une grille TEM avec l’échantillon avec des cellules orientées vers le bas jusqu’à l’anneau C et fixez-la avec un clip C.
  5. Placez les cartouches clipsées dans la boîte de grille et fermez-les correctement.
  6. Stockez les cartouches dans le LN2 Dewar ou chargez-les dans le microscope FIB-SEM.

4. Chargement et manipulation de l’échantillon au microscope FIB-SEM

REMARQUE: Les instructions ont été écrites pour l’utilisation du microscope à double faisceau Versa 3D équipé du système de préparation cryo-FIB / SEM PP3010. Les solutions alternatives peuvent nécessiter différents paramètres spécifiques; toutefois, le concept général du flux de travail doit toujours être valide.

  1. Refroidissez le microscope jusqu’à la température de l’azote liquide.
    1. Pomper la chambre du microscope et la chambre de préparation (le cas échéant) dans un vide poussé avant le début du refroidissement (< 4 x 10-4 Pa) pour éviter la croissance de la contamination.
    2. Réglez le débit d’azote gazeux à 5 L/min pour la chambre de préparation, l’étage du microscope et l’anticontaminateur du microscope. Attendez que tous les composants atteignent une température de < -180 °C.
      REMARQUE: La configuration du microscope FIB-SEM utilisée dans cette étude utilise de l’azote gazeux refroidi pour refroidir son étage et un anticontaminateur. D’autres systèmes peuvent utiliser une méthode différente pour le refroidissement par étage. La pression de la chambre atteint ~3 x 10-5 Pa une fois que l’étage et l’anticontaminateur sont à -190 °C sur l’instrument utilisé ici. Le taux de croissance de la couche contaminante aux hydrocarbures à la surface de la lamelle avec la configuration expérimentale utilisée dans cette étude est d’environ 15 nm / heure.
  2. Chargez la cartouche de grille avec l’échantillon au microscope.
    1. Assemblez et refroidissez la station de chargement à la température LN2.
    2. Placez la navette (porte-échantillon), la boîte de grille avec l’échantillon, l’ouvre-boîte de grille et la pince à épiler dans la station de chargement refroidie.
    3. Transférez soigneusement la cartouche de grille avec l’échantillon tourné vers le haut dans la navette.
    4. Retournez la navette à l’intérieur de la station de chargement jusqu’à la position de chargement.
    5. Charger dans le microscope.
  3. En option, enduisez l’échantillon de couches protectrices métalliques.
    REMARQUE: Un fort effet de charge peut être observé lors de l’imagerie du matériel biologique hydraté congelé SEM. De plus, l’imagerie d’échantillons biologiques avec FIB (même à de faibles courants) induit des dommages rapides aux échantillons. Par conséquent, un revêtement supplémentaire de l’échantillon pourrait être effectué à l’intérieur du microscope FIB-SEM, pour protéger la surface de l’échantillon.
    1. Déposez la couche protectrice avec du platine organométallique par le système d’injection de gaz (SIG).
      1. Réglez l’échantillon à la hauteur eucentrique (point de coïncidence pour l’imagerie avec des électrons et des ions).
      2. Inclinez la scène vers l’arrière à 45° (échantillon incliné de 90° par rapport au faisceau d’électrons).
      3. Déplacez la scène dans l’axe z4 mm en dessous de la hauteur eucentrique.
      4. Réglez l’aiguille SIG sur 26–30 °C.
      5. Déposer ~300-1000 nm de la couche de platine organométallique sur la grille avec le spécimen biologique (correspond à 30-120 s du dépôt SIG).
        REMARQUE: Nous appliquons généralement le SIG pendant 30 s pour les échantillons avec de petits amas cellulaires et 45 s pour les échantillons avec une monocouche de cellules.
    2. Les pulvérisations recouvrent la surface de l’échantillon d’une couche métallique conductrice.
      1. Déposer ~10 nm de la couche métallique (Ir, Au, Pt) sur la grille avec un spécimen biologique.
  4. Définir les paramètres du microscope pour la préparation de la lamelle
    1. Pour FIB, utilisez les paramètres suivants : haute tension = 30 kV, courant = 10 pA (imagerie), 10 pA–3 nA (fraisage FIB)
    2. Pour le MEB, utilisez les paramètres suivants : haute tension = 2–5 kV, taille du spot = 4,5, courant = 8–27 pA.
    3. Réglez la rotation du balayage sur 180° pour les deux faisceaux.
    4. Réglez l’inclinaison de la scène: angle de fraisage 6-11 ° (correspond à l’inclinaison de la scène de 13 ° à 18 ° pour la navette d’échantillon avec pré-inclinaison de 45 ° et microscope FIB / SEM avec angle de 52 ° entre la colonne SEM et FIB).

5. Préparation de la lame De Saccharomyces cerevisiae

  1. Vérifiez la qualité de la grille et sélectionnez un groupe approprié de Saccharomyces cerevisiae.
    1. Vérifiez que la grille TEM est correctement effacée des deux côtés sans eau supplémentaire autour du groupe de cellules ou à l’arrière de la grille.
      REMARQUE: Afin de vérifier l’arrière de la grille, faites pivoter la scène à -10 ° et imagez la grille avec FIB.
    2. Sélectionnez les amas de cellules optimaux pour la préparation de lamelle selon les recommandations suivantes.
      1. Positionnez les grappes de cellules au centre de la grille. La zone de fraisage ne doit pas s’étendre à l’extérieur du carré avec des dimensions de 1100 x 1100 μm positionnées au centre de la grille (550 μm dans chaque direction à partir du centre de la grille).
      2. Placez les grappes de cellules dans la partie centrale du carré de la grille sans chevauchement avec la barre de grille.
      3. Positionnez les grappes de cellules dans le carré de la grille avec une feuille de carbone trouée compacte sans fissures.
      4. Assurez-vous que la grappe n’est pas entourée de contamination par la glace.
  2. Sélectionnez la position de fraisage optimale dans la monocouche Saccharomyces cerevisiae.
    1. Assurez-vous que les barres de grille entourant la monocouche de cellule sur le carré de grille sélectionné sont visibles.
    2. Sélectionnez la position optimale dans la monocouche cellulaire selon les recommandations suivantes. Les zones sélectionnées pour le broyage doivent satisfaire aux critères suivants :
      1. Avoir la région d’intérêt dans le centre de la grille. La zone de fraisage ne doit pas s’étendre en dehors du carré de dimensions 1100 x 1100 μm positionné au centre de la grille (550 μm dans chaque direction à partir du centre de la grille).
      2. Avoir la région d’intérêt dans la partie centrale du carré de la grille sans chevauchement avec la barre de grille.
      3. Ne pas entourer la monocouche cellulaire de la contamination par la glace.
  3. Préparer S. cerevisiae lamella avec cryo-FIB.
    REMARQUE : Le motif de fraisage est généré et centré par rapport à la région d’intérêt. Cryo-FIBM est effectué séquentiellement avec plusieurs étapes de fraisage effectuées à différents réglages FIB. La lame d’une épaisseur d’environ 2 μm est initialement fraisée à l’aide d’un courant élevé (0,3–3 nA). La lamelle est ensuite progressivement amincie jusqu’à 500 nm. L’étape de fraisage fin à faible courant (10-30 pA) est utilisée pour finaliser la lame à ~100–200 nm d’épaisseur.
    1. Définissez une région d’intérêt (ROI) sur la hauteur eucentrique et enregistrez cette position.
      REMARQUE: Le point de coïncidence doit être déterminé et enregistré pour chaque position séparément. La hauteur eucentrique est réglée en inclinant la scène à 0° et en se centrant sur le retour sur investissement en déplaçant la scène dans les directions x et y. La scène est ensuite inclinée à 25° et le retour sur investissement est ramené au centre de la zone scannée en modifiant la position de l’axe zde l’étape. Enfin, la scène est inclinée vers l’arrière à 13°–18° pour le fraisage.
    2. Définissez un motif de fraisage rectangulaire au-dessus du retour sur investissement avec une direction de balayage de haut en bas.
    3. Définissez un motif de fraisage rectangulaire sous le retour sur investissement avec une direction de balayage de bas en haut.
    4. Définissez le motif de fraisage rectangulaire inactif couvrant la région d’intérêt pour une estimation approximative de l’épaisseur de la lame. Ce motif n’est pas broyé pendant la préparation de la lamelle.
    5. Marquez tous les motifs et définissez la largeur de la lame(x dimension). La largeur du motif de fraisage ne doit pas dépasser les 2/3 de la largeur du cluster. Cela correspond à 8–15 μm dans la plupart des cas.
    6. Définir les paramètres des étapes de fraisage brutes
      1. Courant FIB : 0,3–3,0 nA ; épaisseur finale de la lame : 1,5–2 μm ; largeur de la zone FIBM: 8-12 um; inclinaison de la scène: 13-17 °; durée: 8 minutes; motifs de fraisage actifs: supérieur et inférieur.
      2. Courant FIB : 0,3–1,0 nA; épaisseur finale de la lame: 1 μm; largeur de la zone FIBM: 7,5-11,5 μm; inclinaison de la scène: 13-17 °; durée: 8 minutes; motifs de fraisage actifs: supérieur et inférieur.
      3. Courant FIB : 100–300 pA ; épaisseur finale de la lame : 0,5 μm ; largeur de la zone FIBM: 7,5-11,5 μm; inclinaison de la scène: 13-17 °; durée: 8 minutes; motifs de fraisage actifs: supérieur et inférieur.
      4. Courant FIB : 30–100 pA ; épaisseur finale de la lame : 0,3 μm ; largeur de la zone FIBM: 7,5-11,5 μm; inclinaison de la scène: 13-17 °; durée: 8 minutes; motifs de fraisage actifs: supérieur et inférieur.
    7. Définissez les paramètres de l’étape de fraisage fin :
      1. Courant FIB : 10–30 pA; épaisseur finale de la lamelle: <0,2 um; largeur de la zone FIBM: 7-11 μm; inclinaison de la scène: 13-17 ° (+1 °); durée: 12 minutes; motifs de fraisage actifs: supérieur.
        REMARQUE: Les étapes de fraisage brutes (5.3.6) sont effectuées séquentiellement pour chaque lamelles. En revanche, l’étape de fraisage fin (5.3.7) ne suit pas directement le fraisage brut, mais les étapes de fraisage fin sont effectuées séquentiellement pour toutes les lamelles à la fin de la séance afin de minimiser la contamination par les hydrocarbures à la surface de la lame. Une inclinaison supplémentaire de +1° est utilisée lors de l’étape de fraisage fin pour augmenter l’uniformité de l’épaisseur de la lame sur toute sa longueur.

6. Transfert de Saccharomyces cerevisiae lamella vers cryo-TEM

  1. Préparez un Dewar correctement séché et remplissez-le de LN2.
  2. Déchargez les échantillons avec des lamelles du microscope FIB/SEM dans des conditions cryogéniques, transférez-les dans une boîte à grille et stockez-les dans un Dewar de stockage LN2 pour un stockage à long terme. Alternativement, chargez les grilles directement dans cryo-TEM.
  3. L’orientation correcte de la lamelle par rapport à l’axe d’inclinaison de l’étage cryo-TEM est importante (voir la vidéo d’accompagnement à 8:10 pour plus de détails). Assurez-vous que la direction de fraisage des lamelles préparées est perpendiculaire à l’axe d’inclinaison de l’étage cryo-TEM.
  4. Pré-inclinez l’étage cryo-TEM pour compenser l’inclinaison de la lame par rapport au plan de la grille et collectez la série d’inclinaisons en utilisant un schéma dose-symétrique19.
    REMARQUE: L’amplitude de la pré-inclinaison (généralement 6–8°) est déterminée par l’angle entre le plan de la grille TEM et la direction FIB pendant le micro-usinage. La position du bord avant de la lamelle dans l’image dans cryo-TEM peut être utilisée pour déterminer le signe de l’angle de pré-inclinaison. Pour cela, le sens de la rotation de l’étage du microscope doit être connu. Dans notre configuration expérimentale, la position du bord avant de la lamelle sur le côté droit de l’image prise en mode SA nanosonde correspond à une pré-inclinaison négative.

Résultats

La culture saccharomyces cerevisiae a été récoltée au milieu de la phase de croissance exponentielle. Nous avons préparé deux types d’échantillons dans lesquels les cellules étaient soit distribuées sous forme de petits groupes de plusieurs cellules sur la surface de la grille TEM (Figure 1A, C) ou formaient une monocouche continue sur des carrés de grille individuels de la grille TEM ( Figure1B, D). Le facteur discriminant pour la préparation de l’échantillon avec des îlots cellulaires distincts ou la monocouche cellulaire est la concentration de la culture cellulaire appliquée à la grille TEM. La culture cellulaire récoltée a été concentrée àOD 600 = 1,0 pour le premier cas, ou à OD600 = 30 à 60 pour le second cas, respectivement. L’échantillon pour la préparation de la monocouche cellulaire a été complété par du glycérol à 5% v /v avant la vitrification. Le glycérol est essentiel pour la vitrification de la solution tampon, qui remplit l’espace entre les cellules(Figure 2),car les réflexions du tampon cristallin peuvent être préjudiciables au suivi et à la mise au point de la position lors de la collecte de données cryo-ET.

De plus, la culture de suspension de levure a été épongée contre le matériau non absorbant tel que le tampon de buvard en PTFE ou le tampon imprimé en 3D personnalisé en matériau FlexFill 98A. Le papier buvard a été positionné uniquement à l’arrière de la grille par rapport à l’application de l’échantillon (back-blotting). La stratégie de rétro-blotting est recommandée pour la congélation en suspension car le buvard avec le papier filtre des deux côtés entraîne l’adhérence des cellules au papier buvard (Figure 1E).

Le protocole décrit ici utilise des grilles TEM clipsées dans la cartouche de grille, ce qui constitue un support stable pour la grille et facilite la manipulation de l’échantillon après la vitrification. Cela impose la nécessité que d’autres porte-échantillons et navettes dans les microscopes FIB/SEM et TEM puissent accepter une telle cartouche de grille.

Lors du transfert de l’échantillon dans le microscope FIB/SEM, l’échantillon a d’abord été recouvert d’une couche de 0,3 à 1,0 μm de platine méthylcyclopentadiényle à l’aide du système d’injection de gaz au microscope (SIG). Une couche supplémentaire d’iridium inorganique a été pulvérisée sur la surface de l’échantillon pour durcir la couche SIG et rendre la surface conductrice. Les lamelles ont été fraisées en plusieurs étapes(figure 3)où (I) le courant de fraisage, (II) la largeur de la lame et (III) la distance de la zone de fraisage au-dessus et au-dessous des échantillons ont été réduits progressivement. L’étape finale de fraisage (« polissage ») a été effectuée à faible courant (10-30 pA) uniquement à partir de la face supérieure de la lame et avec l’échantillon incliné de 1° supplémentaire vers le faisceau Ga+. L’utilisation du protocole décrit a en moyenne abouti à 8 à 10 lamelles préparées sur deux grilles TEM en une session de 6 à 8 heures.

Les grilles TEM avec les lamelles ont ensuite été transférées dans un microscope électronique à transmission. Les lamelles ont d’abord été criblées et seules celles qui présentaient un rideau minimal (artefacts provenant d’un fraisage inégal sur la surface de la lame), un faible niveau de contamination de surface et un bon contraste cellulaire (généralement observé pour les lamelles d’une épaisseur de <200 nm) ont été sélectionnées pour l’acquisition des données cryo-ET. De plus, les lamelles contenant des fissures sur toute la longueur ont été éliminées de la collecte de données. En général, environ 50 % des lamelles transférées à la GDT convenaient à l’acquisition de données. Les séries d’inclinaison ont été collectées sur le détecteur d’électrons directs K2 post-GIF avec la fente de sélection d’énergie réglée sur 20 eV. La collecte de données a été réalisée dans le logiciel SerialEM18 et les séries d’inclinaison ont été collectées à l’aide d’un schéma symétrique de dose19 avec une plage d’inclinaison de ±60° et un incrément de 3°. Les données ont été acquises au grossissement correspondant à la taille de pixel de 3,47 A/px. La dose globale de 65 e/Å2 a été répartie uniformément sur les différents sous-cadres. Les images d’inclinaison ont été collectées sous la forme d’un ensemble de trois images, qui ont ensuite été corrigées pour les dommages causés par le mouvement et le rayonnement lors de l’acquisition de données à l’aide du programmeMotionCor2 20. Les paramètres de la fonction de transfert de contraste ont été estimés à l’aide de Ctffind421. Les séries d’inclinaison ont été traitées dans eTomo18. La routine de suivi des correctifs a été utilisée pour aligner les images. Le tomogramme a été reconstruit à l’aide d’un algorithme de rétroprojection pondéré après 2x binning des images, puis filtré à l’aide d’un filtre de type SIRT (défini sur 8 itérations) dans IMOD18. La segmentation du tomogramme a été effectuée manuellement dans le logiciel Amira22. Les tomogrammes reconstruits fournissent une représentation à haute résolution de l’intérieur cellulaire de la levure et nous permettent d’observer des organites tels que des vacuoles ou des mitochondries à un niveau de détail élevé ou d’étudier des complexes macromoléculaires tels que des microtubules, ou des complexes de pores nucléaires in situ et dans des conditions quasi natives (Figure 4).

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Figure 1 : Images FIB et SEM de S. cerevisiae vitrifiée
Images FIB (A) et SEM (C) des petits amas de levures vitrifiés sur la grille TEM. Images FIB (B) et SEM (D) de la levure formant une monocouche continue sur la surface de la grille. L’échantillon a été recouvert d’un SIG et d’une couche d’irridium avant l’imagerie. Les barres d’échelle dans les panneaux A-B correspondent à 10 μm. L’échantillon de levure est comprimé contre un matériau non absorbant tel que le PTFE ou le FlexFill 98A (vert) et avec le papier buvard positionné à l’arrière de la grille (blanc, E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : S. cerevisiae lamellae
Image TEM d’une lamelle micro-usinée à partir de l’échantillon avec de la levure monocouche continue sur la surface de la grille. Les réflexions observées entre les cellules contenaient un milieu/tampon mal vitrifié(A,surligné de cercles rouges). Une image TEM de lamelle générée sur la levure vitrifiée en une monocouche continue avec l’ajout de 5% de glycérol dans le milieu/tampon (B). La barre d’échelle correspond à 2 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Flux de travail Cryo-FIBM
Représentation schématique du processus de fraisage à lamelles. Les premières étapes de fraisage brut sont effectuées à des courants FIB élevés des deux côtés de la position provisoire de la lame (surlignée en vert), tandis que l’étape de polissage finale est effectuée uniquement à partir du côté supérieur et à un faible courant FIB (surligné en orange, voir la vidéo d’accompagnement à 6:33). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Organites de levure et complexes macromoléculaires représentés par cryo-ET
Tranches des tomogrammes reconstruits représentant une vacuole (A, barre d’échelle: 200 nm), des ribosomes (B, barre d’échelle: 200 nm), un noyau paracristallin de peroxysome (C, barre d’échelle: 100 nm), un microtubule (flèche blanche) à proximité d’une structure fibreuse non identifiée (flèche noire, D, barre d’échelle: 100 nm), détails de plusieurs microtubules (E, barre d’échelle: 50 nm), une membrane nucléaire avec des pores indiqués par des flèches (F, barre d’échelle 200nm), mitochondrie (G,H, barre d’échelle: 100 nm, les flèches indiquent cristae individuelle), un faisceau de structures filamenteuses non identifiées (I, barre d’échelle: 100 nm). Les panneaux B, C, D, E, G contiennent une section de tomogrammes préparés à partir de petits amas de cellules tandis que les sections de tomogrammes collectées sur les lamelles à partir d’une monocouche des cellules sont représentées dans les panneaux A, F, H, I. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La préparation des échantillons cellulaires pour cryo-ET est un flux de travail complexe qui nécessite l’utilisation de plusieurs instruments haut de gamme. La qualité de l’échantillon peut être compromise à chaque étape de préparation, ce qui influence le débit de l’ensemble du protocole. En outre, la nécessité du transfert d’échantillons entre instruments individuels présente un risque supplémentaire de contamination ou de dévitrification des échantillons. Par conséquent, l’optimisation des étapes individuelles du flux de travail de préparation des échantillons est d’une grande importance pour augmenter le débit et la reproductibilité du flux de travail de préparation des lamelles. Le protocole présenté ici décrit la préparation optimisée de Saccharomyces cerevisiae pour la caractérisation structurale de complexes macromoléculaires in situ par cryo-ET.

Le protocole décrit la préparation de deux types d’échantillons de levure qui diffèrent principalement par la concentration des cellules sur la grille TEM. Les deux échantillons de levure ont donné des lamelles de haute qualité pour cryo-ET et la sélection du type d’échantillon peut être effectuée conformément aux objectifs de l’étude particulière. La levure forme des grappes isolées de quelques cellules dispersées aléatoirement sur la surface de la grille dans le premier cas, tandis qu’une monocouche continue de cellules est présente sur la surface de la grille TEM pour le deuxième type d’échantillon. Le premier convient à la préparation rapide des lamelles grâce au petit volume du matériau qui doit être fraisé. La lamelle finale est assez courte et, par conséquent, ne contient que 2 à 4 sections transversales cellulaires. Les zones adaptées à la préparation des échantillons sont réparties de manière aléatoire sur la surface de la grille, y compris les carrés de la grille, ce qui peut restreindre partiellement l’automatisation du flux de travail de préparation de la lamelles. Ce dernier type d’échantillon nécessite l’utilisation de courants plus importants pendant la phase de broyage initiale pour conserver le temps de fraisage global. De plus, ce type d’échantillon est plus sujet aux artefacts qui proviennent d’un fraisage inégal (rideaux). Par conséquent, le SIG est pulvérisé sur la surface de l’échantillon pendant une période 50% plus longue que dans le cas de l’échantillon avec de petits amas cellulaires pour former une couche protectrice plus épaisse. Ensuite, l’échantillon est pulvérisé avec une couche supplémentaire d’iridium (alternativement du platine ou de l’or) pour durcir la couche SIG, la rendre plus rigide et augmenter la conductivité de surface de l’échantillon. FiBM de zones supplémentaires de chaque côté de la lame (~ 2-5 μm du bord de la lame) au cours de la première étape du fraisage de la lame rugueuse s’est avéré bénéfique pour diminuer le nombre de lamelles cassées, probablement en raison de la diminution de la tension dans la section transversale finale23. La lame finale est longue et contient environ 10 sections transversales cellulaires, ce qui augmente le nombre de régions adaptées à la cryo-ET. La vitrification incorrecte du milieu ou du tampon entre les cellules peut être facilement atténuée par l’ajout du cryo-protection à la solution tampon (5% de glycérol utilisé dans cette étude). Étant donné que la plupart des carrés conviennent à la préparation de lamelles, l’échantillon avec des cellules organisées en une monocouche continue est bien adapté à la préparation de lamelles non supervisées.

Un autre aspect important du flux de travail de préparation de la lamelles est le transfert au microscope électronique à transmission et le positionnement correct de la lame sur l’axe d’inclinaison de l’étage du microscope. De manière optimale, l’axe principal de la lame est perpendiculaire à l’axe d’inclinaison du microscope, ce qui permet de suivre et de faire la mise au point à la hauteur de la région imagée et empêche les bords de la lame de protéger le champ de vision à des angles d’inclinaison élevés. Lors de la collecte des données cryo-ET à l’aide du schéma dose-symétrique18, l’échantillon doit être initialement tourné au microscope pour compenser l’inclinaison de la lamelle par rapport au plan de la grille.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) financé par le programme Horizon 2020 de la Commission européenne, et l’infrastructure de recherche CIISB, un centre Instruct-ERIC (LM2018127). Nous reconnaissons le soutien obtenu de Thermo Fisher Scientific Brno.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarHimediaMB053
GlucosePENTA12020-31000
GlycerolMerckG5516-1L
ethaneMesser1007
LN2LineqLN2-1L
PeptoneMerckP5905-1KG
Saccharomyces cerevisiaeATCC201388strain BY4741
TweezersDumontT539
Yeast extractDuchefa BiochemieY1333.1000
Disposable
Blotting papersTed Pella47000-10
C-clipThermoScientific9432 909 97551
C-clip ringThermoScientific9432 909 97561
Spreading sticksMerckZ376779-1PAK
Sterile inoculation loopsBRANDBR452201-1000EA
Sterile plastic Petri dishesSigmaSIAL0166
TEM gridsQuantifoil4420G-XA
Equipment
AutoclaveSystec101291545
balancesBELM124A
Cryo-FIB/SEM microscopeThermoScientific1006123
Cryo-TEM microscopeThermoScientific9432 057 03301
Laminar flow boxTelstarAH5
Plasma cleanerGatan955.82001
Shaking incubatorNew BrunswickM1282-0002
UV/VIS spectrophotometerWPAS800
Vitrification robotThermoScientific9432 053 50621

Références

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