Génération de xénogreffes larvaires de poisson zèbre et analyse du comportement tumoral

Résumé

Ici, nous fournissons un protocole étape par étape, avec des conseils pour générer des xénogreffes et des directives pour l’analyse du comportement tumoral, l’immunofluorescence de montage entier et la quantification de l’imagerie confocale.

Résumé

Les xénogreffes larvaires de poisson zèbre sont largement utilisées pour la recherche sur le cancer afin d’effectuer des études in vivo et en temps réel sur le cancer humain. La possibilité de visualiser rapidement la réponse aux thérapies anticancéreuses (chimio, radiothérapie, et biologiques), à l’angiogenèse et aux métastases avec la résolution unicellulaire, place le modèle de xénogreffe de poisson zèbre comme un premier choix pour développer des études précliniques.

Le test de xénogreffe larvaire du poisson zèbre présente plusieurs avantages expérimentaux par rapport à d’autres modèles, mais le plus frappant est probablement la réduction de l’échelle de taille et, par conséquent, du temps. Cette réduction d’échelle permet l’imagerie unicellulaire, l’utilisation d’un nombre relativement faible de cellules humaines (compatibles avec les biopsies), les criblages de médicaments à débit moyen-élevé, mais surtout permet une réduction significative du temps de l’essai. Tous ces avantages rendent le test de xénogreffe de poisson zèbre extrêmement attrayant pour de futures applications de médecine personnalisée.

Beaucoup de protocoles de xénogreffe de poisson zèbre ont été développés avec une grande diversité de tumeurs humaines ; cependant, il n’existe toujours pas de protocole général et normalisé pour générer efficacement des xénogreffes larvaires de poisson zèbre. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape, avec des conseils pour générer des xénogreffes et des directives pour l’analyse du comportement tumoral, l’immunofluorescence de montage entier et la quantification de l’imagerie confocale.

Introduction

Le poisson zèbre (Danio rerio) émerge comme un puissant organisme modèle de vertébrés pour étudier le développement et les maladies. Le poisson zèbre partage des caractéristiques génétiques hautement conservées (~ 70% d’homologie génétique et ~ 84% de gènes liés à la maladie) et morphologiques des organes de base avec les humains^1,2. Cette conservation permet l’utilisation du poisson zèbre pour modéliser plusieurs maladies humaines, dont le cancer^3,4.

La manipulation et l’entretien du poisson zèbre sont beaucoup plus faciles et plus rentables que les souris en raison de leur petite taille, de leur fécondité élevée toute l’année et de leur fertilisation externe^3,5. Les embryons de poissons zèbres ne nécessitent pas d’alimentation vivante pendant leurs 5-7 premiers jours de vie et ont été utilisés comme modèle efficace pour le développement, l’infection et le cancer^1,4,6,7. Les embryons de poissons zèbres éclosent 48 heures après la fécondation (hpf) et sont des animaux nageurs libres avec tous les organes formés, un cœur battant et un système circulatoire fonctionnel, le foie, le cerveau, la moelle rénale, etc.^1,3. De plus, à ce stade de développement, seule l’immunité innée est en jeu, l’immunité adaptative se développe encore, permettant une greffe générale efficace des cellules humaines sans avoir besoin d’utiliser des mutants immunodéprimés^7,8. Néanmoins, il est important de noter que toutes les cellules humaines ne se greffent pas également⁹ et que, par exemple, pour les cellules leucémiques, il a été démontré que les phagocytes (neutrophiles et macrophages) doivent être épuisés pour une greffe efficace¹⁰.

La tractabilité génétique du poisson zèbre et la transparence optique de ses premiers stades embryonnaires permettent une imagerie intravitale unicellulaire à haute résolution et, par conséquent, l’établissement de techniques d’imagerie de pointe dans divers domaines de la biologie. En outre, dans le contexte du cancer, ces caractéristiques sont utiles pour des études en temps réel des premiers stades des interactions hôte-tumeur, comme l’étude du potentiel angiogénique et métastatique, ainsi que des interactions avec le système immunitaire inné^{8,9,11,12,13.}

Bien que dans le court test de xénogreffe, il n’y ait pas de temps pour « l’évolution » métastatique- il est possible d’analyser la capacité métastatique des cellules tumorales (c’est-à-dire leur efficacité à passer par des étapes métastatiques comme l’invasion, l’intravasation, la survie en circulation, l’extravasation et la colonisation, et donc d’étudier ces processus in vivo eten temps réel^{8,11, 13,14}).

Les caractéristiques de son cycle de vie placent le poisson zèbre comme un modèle unique de médecine personnalisée dans le cancer. Les essais peuvent être effectués dans un laps de temps plus court et les résultats obtenus en quelques semaines^{7,8,9,11,12,15,16.} La célérité et la faisabilité de ces essais offrent aux médecins et aux chercheurs la possibilité d’obtenir des résultats translationnels qui peuvent être utiles pour les patients atteints de cancer, pour qui le temps est un besoin essentiel.

Malgré les tentatives croissantes de générer des xénogreffes réussies d’embryon de poisson zèbre, il y a toujours un besoin pour la normalisation du procédé d’injection aussi bien que l’évaluation de la viabilité de cellules et du comportement de tumeur après injection.

Dans ce protocole, nous fournissons aux chercheurs un guide étape par étape clair et détaillé pour l’injection de lignées cellulaires cancéreuses humaines dans des embryons de poisson zèbre et la fixation, l’immunomarquage, l’imagerie et la quantification ultérieurs du comportement des cellules tumorales.

Protocole

Le modèle du poisson zèbre (Danio rerio) a été manipulé et maintenu conformément aux protocoles standard de la législation européenne sur le bien-être animal, de la directive 2010/63/UE (Commission européenne, 2016) et de la plate-forme de poisson Champalimaud. Tous les protocoles ont été approuvés par le Comité d’éthique animale de Champalimaud et les organisations institutionnelles portugaises - ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética Animal/Animal Welfare and Ethics Body) et DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/Direction générale de l’alimentation et des affaires vétérinaires).

REMARQUE: Avant de commencer l’expérience principale, pratiquez avec la lignée cellulaire hct116 du cancer colorectal humain (CCR). Cette lignée cellulaire est facile à préparer (très proliférative), facile à injecter et se greffe très efficacement (environ 95-100%). Commencez avec des cellules en excès (~ 12x10⁶ cellules, flacon T-75) et des poissons excédentaires (400 poissons) jusqu’à devenir compétent dans la technique, car de nombreuses cellules et poissons seront perdus pendant l’entraînement. Les expérimentateurs sont prêts une fois que la greffe d’environ 95% est atteinte dans les xénogreffes HCT116. Voir la figure 1 pour un schéma du protocole complet.

1. Mise en place pour l’injection

1. Deux semaines avant l’injection, dilatez les cellules en culture (voir le tableau 1 pour un guide détaillé de la confluence in vitro optimale pour l’injection de plusieurs lignées cellulaires).
2. Trois jours avant l’injection, croisez le poisson zèbre du fond souhaité.

2. 24 h avant l’injection

1. Nettoyez les plaques d’embryons de poisson zèbre (jetez tous les embryons morts et non développés) et rafraîchissez le milieu E3.
2. Dans la salle de culture cellulaire, jetez le milieu de culture cellulaire des flacons prévus pour l’injection, lavez une fois avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les cellules mortes et ajouter du milieu frais.
3. Préparer les outils pour la procédure d’injection, tels que: aiguilles de microinjection, plaques d’agarose et épingles à cheveux pour aligner les embryons pour injection(Figure 2A-D, détaillé ci-dessous).
   1. Aiguilles à microinjection (Figure 2A)
      1. Utilisez des capillaires en verre borosilicate (4 pouces, OD 1,0 mm, pas de filament dans un tiroir à micropipette (chaleur: ≈500; fil: 10; vel: 50; déc: 60; traction: 100).
   2. Préparation des tôles (Figure 2B)
      1. Préparez 2% d’agarose dans_H2O,faites-le chauffer et versez une couche d’agarose dissoute dans le couvercle d’une boîte de Petri propre. Laissez-le polymériser et à l’aide d’une règle, faire trois à quatre lignes droites d’agarose pour l’alignement des embryons.
   3. Épingle à cheveux(figure 2C-D)
      1. Placez 1 cheveu à l’intérieur d’un tube capillaire en verre en laissant environ 1 centimètre de cheveux à l’extérieur du tube.
      2. Enroulez la pointe extérieure des cheveux à l’aide de pinces dans le tube capillaire en verre formant une boucle d’environ 0,5 mm de longueur.
      3. Sceller le bord du tube capillaire avec une goutte de vernis à ongles. Cela aidera également à corriger la boucle en place. Laissez sécher. Répétez la procédure sur l’autre bord du tube.
      4. Coupez un morceau de ruban électrique (plus résistant, imperméable et rigide que le ruban adhésif ordinaire).
      5. Scellez le ruban autour du capillaire pour le protéger de la rupture.

3. Jour d’injection

1. Séparez les embryons éclos des œufs non éclos. L’ajout de 1x pronase (0,6 mg/mL, tableau 3)au milieu embryonnaire à ce stade peut stimuler l’éclosion. Placez les embryons dans l’incubateur (à 28 °C) jusqu’à l’injection.
   REMARQUE: Ne laissez pas les embryons dans la solution de pronase pendant plus de 1 heure, car l’enzyme agira sur les embryons éclos en augmentant leur risque de mortalité. S’assurer que le stade de développement des embryons est celui correspondant à 48 hpf(figure 3A,A') afin d’éviterle risque d’œdème et de mortalité.
2. Préparez 1x Tricaine (à partir d’un stock 25x).
   REMARQUE: Une recette détaillée peut être trouvée dans le tableau 3 et sur le réseau d’information sur le poisson zèbre - page Web^{ZFIN 17}.

4. Étiquetage cellulaire pour injection

NOTA : L’étiquetage des cellules peut être effectué soit directement dans une fiole, soit dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL après décollement enzymatique. Voir Discussion pour plus d’informations.

1. Retirer le milieu de culture cellulaire et laver le ballon deux fois (2x) avec du PBS 1X.
2. Étiqueter les cellules avec un colorant lipophile de choix soit directement dans la fiole (solution de 2 mL/fiole T75), soit dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL après décollement enzymatique. Éviter l’exposition à la lumière et incuber les cellules à 37 °C (voir le tableau 1 et le tableau 2 pour les conditions et les solutions).
3. Si l’étiquetage dans le ballon
   1. Retirez le colorant, lavez avec 1x PBS et détachez les cellules avec de l’EDTA et un grattoir à cellules.
   2. Transférer les cellules dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL. Centrifuger pendant 5 minutes à 300 x g puis passer à l’étape 4.5.
4. Si l’étiquetage est dans le tube de microcentrifuge de 1,5 mL :
   1. Centrifuger 5 minutes à 300 x g pour enlever le colorant et jeter le surnageant. Ressusciter dans 1x PBS pour laver.
   2. Centrifuger 5 minutes à 300 x g, puis passer à l’étape 4.5.
5. Jetez le surnageant et ressuscitez le granulé avec un milieu de culture cellulaire (pour un granulé de 50 μL, ajoutez ~ 150-200 μL de milieu).
6. Quantifier la viabilité cellulaire à l’aide d’une chambre de Neubauer avec exclusion bleue de Trypan ou d’une autre méthode de choix.
7. Centrifuger pendant 4 minutes à 300 x g et jeter le surnageant. Ressusciter les cellules dans le milieu d’injection.
   NOTA : La concentration cellulaire recommandée (en général de 0,25 à 0,5 x 10⁶ cellules/μL) et le milieu se trouvent dans le tableau 1.
8. À partir de ce moment, gardez les cellules sur la glace.

5. Procédure d’injection

1. Anesthésier les embryons dans 1x Tricaine pendant 5 minutes.
2. Avec une pipette Pasteur en plastique, transférez une petite quantité (~50) d’embryons anesthésiés sur la plaque d’agarose et alignez-les soigneusement à l’aide d’une boucle en épingle à cheveux. Assurez-vous de maintenir la distance entre les embryons, en particulier entre le jaune de l’un et la tête du suivant (Figure 4A).
   NOTA : Le nombre d’embryons à aligner variera selon le niveau d’expertise du chercheur qui effectue les injections. Commencez par quelques-uns (~ 10-20). Pour un schéma du positionnement correct des embryons dans la plaque d’agar/agarose, voir la figure 4A.
3. Assurez-vous que les embryons alignés ne se dessèchent pas dans la plaque d’agarose pour prévenir la mortalité, en ajoutant soigneusement 1-3 gouttes de 1x solution de tricaine à la plaque.
4. Appuyez légèrement sur le tube de microcentrifugation pour ressusciter les cellules. Chargez l’aiguille d’injection avec la suspension cellulaire à l’aide d’une pointe de microchargeur évitant les bulles d’air, car elles peuvent compromettre l’intégrité des embryons.
5. Ouvrez la soupape de pression d’air (40 psi), réglez le microinjecteur et placez soigneusement l’aiguille de microinjection dans le support.
   REMARQUE: Utilisez les réglages de microinjecteur recommandés suivants: Pression de maintien - évent (3 psi); Pression d’éjection - évent; Portée - 100 ms.
6. Couper l’aiguille de microinjection près de la pointe avec des pinces Dumont #5 ou similaire sous le stéréomicroscope.
   REMARQUE: La pointe doit être émoussé et assez mince pour permettre aux cellules de passer sans colmatage ainsi que pour éviter d’endommager les embryons et de perdre des cellules. Une pointe d’aiguille de microinjection épaisse va blesser l’embryon et favoriser la formation d’œdème ou la mort du poisson zèbre. Graticule n’est pas utilisé pour l’étalonnage de l’aiguille. Voir discussion pour une explication détaillée.
7. Avant d’injecter les embryons, testez la pression du microinjecteur en commençant par la pression d’éjection la plus faible jusqu’à ce qu’en ~1-3 impulsions, un volume similaire à la taille de l’œil de l’embryon de poisson zèbre soit atteint.
   REMARQUE: L’utilisation d’un stéréomicroscope à fluorescence dans la mesure du possible au début de la formation est recommandée. Cela permettra une identification plus facile des cellules marquées par fluorescence.
8. Percer soigneusement au milieu du jaune de l’embryon, en abaissant l’angle de l’aiguille et en poussant prudemment jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille atteigne l’espace périivitellin (PVS)(Figure 4B-D).
9. Appuyez sur la pédale du micro-injecteur et injectez les cellules dans le PVS. Utilisez l’œil de l’embryon comme guide. Essayez d’injecter un volume de cellules similaire à la taille de l’œil de l’embryon et aussi loin que possible du cœur pour prévenir l’œdème cardiaque.
10. Retirez soigneusement l’aiguille et passez à l’embryon suivant.
11. Ajustez la pression du micro-injecteur si nécessaire.
    REMARQUE: Les cellules ont tendance à commencer à obstruer, donc la pression peut être augmentée. Si nécessaire, il est possible de couper le capillaire (pour augmenter le diamètre) tout en réduisant la pression.
12. Transférer les embryons injectés dans une boîte de Pétri propre(tableau 4)avec 1x solution de tricaine et les laisser reposer pendant 5-10 minutes. Cela donnera le temps à la plaie de se referment.
    REMARQUE: Pour transférer les embryons de la plaque de gélose à la boîte de Petri, ajoutez quelques gouttes de solution de tricaine 1x sur les embryons et collectez-les soigneusement avec une pipette Pasteur en plastique. Déposez les embryons collectés dans une nouvelle boîte de Petri avec 1x solution de tricaine.
13. Retirez la solution 1x Tricaine et ajoutez un milieu E3 frais.
14. Incuber les xénogreffes à 34 °C (température compromise entre la survie des lignées cellulaires humaines et le développement du poisson^{zèbre 8}).

6. Essai métastatique

1. À environ 1 heure post-injection (hpi), cribler les embryons injectés sur un stéréomicroscope fluorescent et trier les xénogreffes en 2 groupes, en fonction de l’absence(figure 5A)ou de la présence(figure 5B)de cellules en circulation.
   REMARQUE: Même si une seule cellule cancéreuse est détectée dans le cœur ou la circulation, incluez ces xénogreffes dans le groupe des xénogreffes avec des cellules en circulation. Alternativement, les cellules peuvent être directement injectées dans la circulation pour augmenter le nombre de xénogreffes dans ce groupe.

7. 1 jour après l’injection

1. Sur un stéréomicroscope fluorescent, analysez soigneusement chaque embryon et sélectionnez ceux qui ont des tumeurs correctement injectées (Figure 6).
   REMARQUE: Si nécessaire, anesthésier les embryons injectés avec une solution de Tricaine 1X avant le dépistage.
2. Jeter les embryons/xénogreffes suivants(figure 6A-A'') :
   • sans tumeur/morphologie anormale/mort,
   • avec œdème cardiaque et/ou jaune,
   • avec des cellules tumorales uniquement dans le jaune,
   • avec très peu de cellules cancéreuses.
3. Triez les xénogreffes sélectionnées en fonction de leur taille de tumeur. Utilisez la taille de l’œil à des fins de comparaison(figure 6B-B'', 6C).
   • Tumeurs plus petites que la taille de l’œil (+),
   • Tumeurs de la même taille que l’œil (++),
   • Tumeurs plus grandes que la taille de l’œil (+++).
4. Distribuez les xénogreffes selon la disposition expérimentale souhaitée et commencez le test médicamenteux (contrôle vs médicament, etc.). Remplacez les médicaments et le milieu E3 tous les jours (Tableau 4).
5. Incuber les xénogreffes en maintenant la température de 34 °C jusqu’à la fin du dosage.

8. 4 jours après l’injection

1. Le dernier jour du test, anesthésiez les xénogreffes avec 1x solution de tricaine et alignez-les soigneusement sur la plaque de gélose.
   REMARQUE: Jetez toutes les xénogreffes mortes ou enflées. Les traitements médicamenteux et certaines cellules tumorales peuvent induire une toxicité et éventuellement causer la mortalité par xénogreffe. Ces xénogreffes ne sont pas considérées pour la quantification de l’engraftment.
2. Pour déterminer le pourcentage de greffe : sur un stéréomicroscope fluorescent, analyser chaque xénogreffe vivante et évaluer l’absence(figure 6D)/présence(figure 6E)de tumeurs dans le PVS.
   
3. Pour déterminer le pourcentage de métastases : sur un stéréomicroscope fluorescent, analyser chaque xénogreffe et évaluer la présence/absence de microméthastasie dans le tissu hématopoïétique caudal (TCS) des 2 groupes précédemment définis (CIRC et NO CIRC, figure 6F)
   
4. Selon la configuration expérimentale, sélectionnez les xénogreffes d’intérêt et euthanasiez-les avec 25x Tricaine (Tableau 3).
5. Fixer-les dans du formaldéhyde (FA) à 4 % pendant au moins 4 heures à température ambiante (RT) ou pendant la nuit à 4 °C.
   NOTA : Utilisez du formaldéhyde sans méthanol (16 % d’AF) dilué à 4 % dans du PBS/0,1 % de Triton. Remplissez les tubes vers le haut avec fixateur. Positionner les tubes horizontalement pour assurer une fixation homogène de toutes les xénogreffes, augmentant la perméabilité et empêchant le poisson zèbre de s’agréger au fond.
6. Vous pouvez également les fixer avec des TUYAUX (par 1 mL : 100 μL de sel de sodium 1 M PIPES (4 °C); 1 μL de 1 M MgSO₄ (RT); 4 μL d’EGTA 0,5 M (RT); 93,7 μL de 16 % FA (RT); 801,3 μL de ddH2 O).
   REMARQUE: Pipes préserve la fluorescence des raies transgéniques RFP et mCherry mieux que 4% FA.
7. Si l’immunomarquage doit être effectué un autre jour, remplacez le FA par du méthanol à 100 % (MetOH). Les xénogreffes fixées à 100% de méthanol peuvent être conservées indéfiniment à -20 °C.
   REMARQUE : Le MetOH peut nuire à l’efficacité de certaines taches (c.-à-d. la phalloïde) et éteindre certains étiquetages fluorescents. Confirmer au préalable l’efficacité des anticorps dans les échantillons fixes MetOH.

9. Immunomarquage à montage entier pour l’imagerie confocale

REMARQUE: La technique d’immunofluorescence de montage entier prend 3 jours divisés comme suit: Le premier jour est pour la perméabilisation des xénogreffes et l’incubation d’anticorps primaires. Le deuxième jour pour le lavage et l’incubation des anticorps secondaires et le troisième jour pour le lavage, la fixation des xénogreffes et le stockage dans le support de montage.

1. Jour 1
   1. Si les xénogreffes étaient stockées dans du MetOH à 100 %, réhydratez-les par une série de concentrations décroissantes de MetOH (75 %, 50 %, 25 % de MetOH dilué dans du PBS/0,1 % de Triton). S’il est fixé dans FA, remplacez-le par PBS/0,1 % Triton.
   2. Laver 4x pendant 5 minutes dans PBS/0,1% Triton.
   3. Laver 1x pendant 5 minutes en_H2O.
      NOTA: Les tubes doivent être positionnés horizontalement toujours dans les étapes de fixation, de perméabilisation et de lavage, sauf indication contraire.
   4. Remplacer le_H2O par de l’acétone glacée et incuber à -20 °C pendant 7 minutes.
      REMARQUE: Placez un tube de 50 mL avec de l’acétone à -20 ° C afin qu’il soit prêt à l’emploi. Les tubes à microcentrifugation doivent être positionnés verticalement sur un rack de manière à ce que l’acétone ne s’échappe pas.
   5. Laver 2x pendant 10 minutes dans PBS/0,1% Triton.
   6. Incuber avec PBDX_GS solution bloquante pendant 1 h à TA (tampon de blocage PBDX_GS : 50 mL de 1x PBS ; 0,5 g d’albumine sérique bovine - BSA ; 0,5 mL de DMSO ; 250 μL de Triton à 10 % ; 750 μL de sérum de chèvre - GS (15 μL/1 mL)).
   7. Retirer PBDX_GS et ajouter ~40 μL de dilution d’anticorps primaires (généralement 1:100).
      REMARQUE: Le volume de la dilution d’anticorps primaires varie en fonction du nombre de xénogreffes présentes dans le tube de microcentrifugation. Assurez-vous que toutes les xénogreffes sont immergées.
   8. Incuber pendant 1 heure à TA puis à 4 °C pendant la nuit. Position verticale des tubes.
2. Jour 2
   1. Retirer les anticorps primaires et laver 2x pendant 10 minutes dans pbs/0,1% Triton.
   2. Laver 4x pendant 30 min dans PBS/0,05% Tween.
      REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans l’obscurité (utilisez du papier d’aluminium pour protéger les tubes de la lumière).
   3. Retirer pbs/0,05 % tween et ajouter ~50-100 μL de dilution d’anticorps secondaires (généralement 1:200 - 1:400) + DAPI (50 μg/mL) dilué dans PBDX_GS.
   4. Incuber pendant 1 heure à TA puis à 4 °C pendant la nuit. Positionnez les tubes verticalement et protégez-les de la lumière.
3. Jour 3 (utilisez du papier d’aluminium pour protéger les tubes de la lumière)
   1. Retirer la dilution des anticorps secondaires et laver 4x pendant 15 minutes dans PBS/0,05 % Tween.
   2. Fixer à température ambiante pendant 20 minutes dans 4% FA.
   3. Laver 1x pendant 5 minutes dans PBS/0,05% Tween.
   4. Retirer PBS/0,05 % Tween et ajouter 1 goutte de milieu de montage aqueux à chaque tube à microcentrifuge. Positionnez les tubes verticalement.
   5. Monter ou conserver à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’au montage. Positionnez les tubes verticalement.

10. Montage de xénogreffes

REMARQUE: Protéger les tubes microcentrifuges de la lumière tout au long du processus. Les xénogreffes de poisson zèbre sont montées entre 2 lamaux (24 x 60 mm # 1,5). Cela permet de retourner les xénogreffes montées lors de l’imagerie confocale afin que les deux côtés de la tumeur (en haut et en bas) soient accessibles. N’utilisez pas de pipettes en plastique avec support de montage - les xénogreffes peuvent être prises dans la pipette. Reportez-vous à la figure 7 pour la représentation schématique des étapes suivantes.

1. Étiquetez la lamelle Y et scellez les bords de la lamelle X avec de la vaseline ou de la graisse de silicone pour éviter la fuite du support de montage.
2. Transférer les xénogreffes avec une pipette Pasteur en verre sur la lamelle X.
3. Alignez-les soigneusement avec une épingle à cheveux et retirez l’excès de support de montage aqueux.
4. Ajouter un support de montage aqueux à la lamelle Y.
5. Placez soigneusement la lamelle Y sur la lamelle X. N’appuyez pas sur les lamelle car cela peut potentiellement perturber les xénogreffes.
6. Placez les lamelle de couverture assemblées sur une lame de microscope et fixez-les avec du ruban adhésif transparent. Cela permet une manipulation plus facile pour l’imagerie et le stockage confocaux.

11. Imagerie confocale

REMARQUE: Une lentille d’objectif d’immersion apochromatique 25x avec correction de l’eau est optimale pour l’imagerie des tumeurs PVS avec une résolution unicellulaire (voir figure 8C-C » et figure 9A pour des exemples).

1. Acquérir des échantillons à l’aide de la fonction z-stack avec un intervalle de 5 μm entre chaque tranche. Pour les images destinées à la reconstruction 3D, en particulier dans les vaisseaux, utilisez un intervalle de 1 à 3μm entre les tranches (Figure 8A).

12. Analyse et quantification

1. Utilisez le logiciel FIJI/ImageJ ou similaire pour le traitement et l’analyse d’images confocales.
2. Ouvrez les données brutes (.czi, .lsm, etc.) dans le logiciel FIJI.
3. Pour sélectionner tout ou une seule couche en mode composite, cliquez sur : Image > Couleurs > l’outil Couches.
4. Pour régler les niveaux de luminosité et de contraste, cliquez sur : > d’images Ajuster > la balance des couleurs.
5. Pour quantifier la taille de la tumeur
   1. Sélectionnez trois tranches représentatives de la tumeur, du haut, du milieu et du bas, par z-stack par xénogreffe(figure 8 A).
      REMARQUE: La résolution confocale atteint ~ 60-70 μm de profondeur tumorale. Si la tumeur est grosse, il peut ne pas être possible d’imager son volume total.
   2. Ouvrez une feuille de calcul pour annoter les données.
   3. Comptez chaque noyau DAPI qui correspond aux cellules tumorales dans les 3 tranches sélectionnées(figure 8 A, B). Pour ce faire :
      1. Ouvrez le plugin de compteur de cellules à partir de FIJI / ImageJ en cliquant sur Plugins > Analyser > compteur de cellules.
      2. Dans l’outil compteur de cellules, cliquez sur Initialiser, sélectionnez un type de compteur, puis cliquez sur l’image pour démarrer manuellement le mode de comptage. Pour chaque clic, le compteur ajoute le nombre de cellules comptées (nombre de clics).
      3. Après avoir compté une tranche complète, enregistrez le numéro de cellule dans le document Excel correspondant.
      4. De retour à Fidji, cliquez sur Réinitialiser dans la fenêtre Compteur de cellules pour supprimer les informations si le même compteur sera utilisé. Sinon, les informations peuvent être conservées et d’autres compteurs peuvent être utilisés avec d’autres tranches (ou cellules).
      5. Passez à la deuxième tranche représentative et répétez les étapes précédentes. Rassemblez toutes les données.
         Remarque : DAPI counterstaining est couramment utilisé pour compter les numéros de cellule en raison de la définition claire des cellules individuelles, cependant, d’autres colorations spécifiques de cellule peuvent être utilisées.
   4. Pour obtenir le nombre total de cellules dans la tumeur, utilisez la formule suivante:
      
      REMARQUE : Le nombre de corrections de 1,5 a été estimé pour les cellules dont le diamètre moyen du noyau est d’environ 10 à 12 μm. Cette correction peut nécessiter un ajustement si les cellules sont plus grandes/ plus petites. Voir Dicussion pour plus de détails sur cette méthode.
6. Pour quantifier d’autres marqueurs (cellules immunitaires, figures mitotiques, PPH3, Caspase3 activée, Ki67, etc.), quantifier toutes les tranches à l’aide du même plugin (voir la figure 8C-C'' pour la visualisation des figures mitotiques). Divisez le nombre total de cellules comptées par la taille de tumeur correspondante et multipliez par 100 pour obtenir le pourcentage.
   Remarque : Méfiez-vous que certaines cellules seront situées entre deux tranches, aller et venir dans la pile z pour vous assurer qu’une cellule n’est pas comptée deux fois.

Résultats

Xénogreffe de poisson zèbre comme outil pour étudier les thérapies anticancéreuses.
La variété de cellule de cancer côlorectal HCT116 a été marquée avec CM-DiI et injectée dans le PVS des embryons de 2 jours de poteau de fécondation (dpf). Après injection, les xénogreffes ont été incubées à 34 °C, une température qui permet la croissance des cellules tumorales sans compromettre le développement du poisson zèbre. Le lendemain, les xénogreffes ont été examinées en fonction de la présence ou de l’absence d’une masse tumorale dans le SPV (les poissons zèbres mal injectés ont été rejetés et euthanasiés) (figure 6A-A ''). Les xénogreffes ont été regroupées en fonction de leur tailletumorale (figure 6B-B'') et distribuées aléatoirement (dans une plaque à 6 puits : ~12 xénogreffes par puits) dans des témoins non traités et une chimiothérapie FOLFIRI (acide folinique 0,18 mM, irinotecan 0,08 mM et fluorouracile 4,2 mM (5-FU)).

Le contrôle E3 et les drogues ont été remplacés quotidiennement, et le poisson zèbre mort a été jeté. 4 dpi, et trois jours après traitement (dpt), l’engraftment a été quantifié comme dans l’étape 8.2 du protocole. L’engraftment est considéré comme la fréquence des xénogreffes qui présentent une masse de tumeur dans le PVS à 4 dpi. Par exemple, si à la fin de l’expérience il y a 40 larves vivantes et 35 sur les 40 présentent une tumeur dans le PVS, le taux de greffe est de 87,5%. Xenografts ont été euthanasiés et fixés pour évaluer la taille et l’apoptosis de tumeur par immunofluorescence et microscopie confocal.

L’immunofluorescence a été réalisée pour détecter les cellules apoptotiques, en utilisant l’anticorps anti-caspase 3 clivé (Asp175) (lapin, 1:100, #CST 9661) et le DAPI (50 μg/mL) pour la contre-coloration des noyaux. Les ensembles de données de la pile d’images (tous les 5um) ont été acquis dans un microscope confocal LSM710 et l’analyse des données effectuée avec le logiciel FIJI / ImageJ comme expliqué à l’étape 12. La quantification de l’index mitotique, de l’apoptose (% de la caspase3 activée) et de la taille de la tumeur, a révélé que FOLFIRI induit une diminution significative de la mitose (test de Mann Whitney, P<0,0001) et une induction significative de l’apoptose (test de Mann Whitney, P<0,0001), accompagnée d’une réduction de 54% de la taille de la tumeur (P<0,001)(figure 8C-E, figure 9A-E).

Ces dispositifs sont utiles dans les criblages phénotypiques à haut débit de drogue aussi bien que pour tester les effets intrinsèques et physiologiques de cellules de plusieurs traitements de cancer dans un court laps de temps.

Caractérisation de xénogreffes de poisson zèbre humain avec des anticorps spécifiques à l’homme
Comme dans tous les modèles de xénogreffe, il existe un risque de mauvaise identification des cellules. Par exemple, les macrophages peuvent phagocyter les cellules cancéreuses humaines, devenant marqués avec le colorant lipophile, puis voyager le long de l’hôte du poisson zèbre et ainsi, ces cellules peuvent être confondues avec la microméthastasie tumorale. Par conséquent, l’étiquetage des xénogreffes avec des anticorps humains spécifiques tels que HLA humain, ki-67 ou mitochondries humaines (hMITO) est crucial pour la caractérisation initiale et aussi pour se familiariser avec la morphologie des cellules tumorales (Figure 9F-I).

Xénogreffe de poisson zèbre pour étudier les interactions cellule-cellule.
Un autre grand avantage du modèle de xénogreffe de poisson zèbre est qu’il est possible d’étudier les interactions de différentes cellules tumorales et d’analyser comment chaque type de cellule peut influencer le comportement de l’autre. Différentes cellules cancéreuses humaines (différents clones de la même tumeur ou de différentes tumeurs) peuvent être co-injectées. Dans cet exemple, deux lignées cellulaires de CRC dérivées du même patient ont été marquées avec différents colorants lipophiles et mélangées dans un rapport de 1:1 pour injection(figure 9J-K').

Lorsque vous mélangez des lignées cellulaires humaines (pour générer des tumeurs polyclonales) sur le même greffon, évitez d’utiliser le colorant DiO car cela entraîne une double coloration non spécifique(tableau 2). Utilisez plutôt par exemple CM-DiI (lignée cellulaire #1) avec CMFDA vert (lignée cellulaire #2), ou CM-DiI (lignée cellulaire #1) avec rouge foncé (lignée cellulaire #2)(Tableau 2, Figure 9J-K'),pour obtenir une discrimination facile des populations à la fin de l’expérience. Pour quantifier la fréquence de chaque clone dans la tumeur, utilisez 2 types de compteurs différents à FIJI pour identifier chaque clone, puis divisez par le nombre total de cellules (somme de tous les clones) pour obtenir la fraction relative de chacun (%).

Figure 1. Résumé de l’organigramme du protocole de xénogreffe de poisson zèbre Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Matériaux pour l’injection d’embryons de poisson zèbre: A. Aiguille borosilicate B. Plaque d’agarose à 2%. C Boucle en épingle à cheveux D. Étapes pour faire une boucle en épingle à cheveux: 1.Placez 1 cheveux à l’intérieur d’un tube capillaire en verre laissant environ 1 centimètre de cheveux à l’extérieur du tube. 2-3. Enroulez la pointe extérieure des cheveux à l’aide de pinces dans le tube capillaire en verre formant une boucle d’environ 0,5 mm de longueur. 4.Scellez le bord du tube capillaire avec une goutte de vernis à ongles. 5-6. Sceller un morceau de ruban électrique autour du capillaire pour le protéger de la rupture. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Images stéréomicroscopiques représentatives d’embryons de poissons zèbres à 48 heures après la fécondation (48 hpf) : A-A'. Morphologie normale d’un embryon de poisson zèbre à 48 hpf de développement, prêt pour la microinjection B-B'. Morphologie d’un embryon de poisson zèbre qui n’a pas atteint le stade de développement adéquat pour les microinjections à 48 hpf et présente déjà un certain degré d’œdème cardiaque (pointe de flèche noire) et de jaune distendu. A' et B' sont des grossissements de A et B respectivement. Les barres d’échelle représentent 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4. Représentation schématique de la plaque de microinjection du poisson zèbre mise en place: A. Alignement des embryons anesthésiés dans une plaque d’agar à 3% / 2% d’agarose. B. Représentation graphique d’un embryon de poisson zèbre de 2 jours après la fécondation, avec une flèche noire indiquant l’espace périivitellin (PVS). C et D. Les cellules cancéreuses peuvent être injectées sous différents angles dans le PVS injecté dans l’espace perivitelline (PVS) d’un embryon post-fécondation de 48 heures. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Essai métastatique. 1 heure après l’injection (1hpi) les embryons injectés sont triés en fonction de l’absence (NO_circ) ou de la présence (CIRC) de cellules tumorales en circulation. À 4 jours après l’injection, le nombre de xénogreffes dans les deux groupes qui présentent une microméthastasie est quantifié. Les cellules du groupe(A)NO_circ ont dû subir toutes les étapes métastatiques pour pouvoir former une microméthastasie, tandis que les cellules du groupe CIRC(B)ne subissent que les dernières étapes de la cascade métastatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. Images représentatives de stéréomicroscope fluorescentes des xénogreffes à 1 jour après l’injection et 4 jours après l’injection. Des cellules cancéreuses humaines exprimant la protéine fluorescente TdTomato (rouge) ont été microinjectées dans des embryons de poisson zèbre de 2 dpf. A 1 dpi, tamisez les embryons injectés et jetez ceux qui sont mal injectés ou les embryons présentant un œdème(A-A'')trient les embryons bien injectés en fonction de la taille des tumeurs(B-B''). C. Quantification représentative du nombre total de cellules présentes dans les différentes catégories de taille de tumeur à 1 dpi dans les xénogreffes SW620. Chaque point représente une xénogreffe quantifiée comme expliqué dans la section 12.At 4 dpi, filtrer les larves et quantifier les différentes classes : pas de tumeur(D); avec une tumeur dans le PVS(E)et avec une microméthastasie dans le CHT(F). Les barres d’échelle représentent 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7. Représentation schématique du montage de la xénogreffe pour l’imagerie confocale. 1. Exemple d’étiquetage dans la lamelle Y, la ligne bleu clair dans la lamelle X représente le périmètre dans lequel la vaseline/graisse de silicone est appliquée pour éviter les fuites du support de montage. 2. Exemples d’alignement de xénogreffe sur la lamelle X pour l’imagerie confocale. 3. Un support de montage aqueux (flèche bleue) est utilisé pour lier la lamelle de couverture Y au-dessus de la lamelle de couverture X. 4. Exemple de lamelle de couverture correctement montée. 5. Les lamaux de couverture sont ensuite placés sur une lame de verre et fixés avec du ruban transparent. 6. Xénogreffes montées prêtes pour l’imagerie confocale. Créé avec BioRender.com Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8. Représentation visuelle de quantification confocal d’image de microscope de taille de tumeur. Images confocales d’une xénogreffe HCT116 à 4 jours après l’injection A. Série de tranches z-stack dans le canal DAPI acquises avec un intervalle de 5 μm. Des lignes pointillées rouges entourent les trois tranches représentatives utilisées pour le comptage des cellules. B. Illustration de la quantification des noyaux DAPI avec le plugin Cell Counter dans le logiciel ImageJ/Fiji. C-E. Exemple de résolution unicellulaire au sein de la tumeur dans laquelle il est possible de visualiser/quantifier des figures mitotiques en DAPI ou à l’aide d’un anticorps phospho-histone H3 (vert). D et E sont des grossissements de C. Les barres d’échelle représentent 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9. Résultats représentatifs. A-E. La variété de cellule de cancer côlorectal HCT116 a été marquée avec Vybrant CM-DiI et injectée dans le PVS des embryons de 2 jours de poteau de fécondation (dpf). Après injection, les xénogreffes ont été incubées à 34 °C. À 1 dpi, des xénogreffes ont été criblées et distribuées aléatoirement dans les contrôles non-traités et FOLFIRI, traitées pendant 3 jours consécutifs et fixées à 4 dpi. A. L’immunofluorescence a été réalisée pour détecter les cellules apoptotiques, en utilisant l’anticorps anti-caspase 3 clivé et le DAPI pour le contre-marquage des noyaux. La quantification de l’index mitotique C,de l’apoptose (% de Activated Caspase3) D, et de la taille de tumeur E,a indiqué que FOLFIRI induit une diminution significative de la mitose (Test de Mann Whitney, P<0,0001) et une induction significative de l’apoptose (test de Mann Whitney, P<0,0001), accompagnée d’une réduction de 54% de la taille de la tumeur (P<0,001). Le nombre de xénogreffes analysées est indiqué dans la figure et chaque point représente une xénogreffe. F-H. Images représentatives de xénogreffes du cancer colorectal à 4 jours après l’injection marquées avec des marqueurs spécifiques humains en vert (HLA humain, ki67 et hMITO) dans le PVS et le CHT I. J-J'. Images confocales de xénogreffes polyclonales, injectées avec deux lignées cellulaires de cancer colorectal humain différentes marquées avec coloration lipophile CellTracker Deep Red (Cy5 - blanc), CellTracker Green CMFDA (488 - vert) et DAPI contre-coloration. K-K'. Images confocales de deux lignées cellulaires de cancer colorectal humain différentes marquées avec coloration lipophile CellTracker Deep Red (Cy5 - blanc), Vybrant CM DiI (594 - rouge) et DAPI contre-coloration. Les barres d’échelle représentent 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Lignée cellulaire

tissu

espèce

morphologie

Mode de croissance

Confluence idéale pour injection

Agent dissociant pour injection

Temps de dissociation

Protocole d’étiquetage

Milieu d’injection

Diviser le nombre total de cellules par (pour atteindre la concentration idéale pour l’injection)

SW480

Adénocarcinome colorectal (primaire)

humain

épithélial

adhérent

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutes

fiole

PBS 1x

0,25

SW620

Adénocarcinome colorectal (métastases)

humain

épithélial

adhérent

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutes

fiole

PBS 1x

0,25

HCT116

Carcinome colorectal (primaire), mutant de Kras

humain

épithélial

adhérent

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutes

fiole

PBS 1x

0,25

HKE3

Carcinome colorectal, Kras WT

humain

épithélial

adhérent

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutes

fiole

PBS 1x

0,25

HT-29

Adénocarcinome colorectal (primaire)

humain

épithélial

adhérent

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutes

fiole

PBS 1x

0,2

CACO-2

Adénocarcinome colorectal (primaire)

humain

épithélial

adhérent

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

Support complet

0,25

MCF-7

Adénocarcinome mammaire (métastases)

humain

épithélial

adhérent

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

60% FBS + 40% moyen complet

0,5

Hs578T

Carcinome du sein (primitif)

humain

épithélial

adhérent

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

2 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

60% FBS + 40% moyen complet

0,5

MDA-MB-468

Adénocarcinome mammaire (métastases)

humain

épithélial

adhérent

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

8 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

60% FBS + 40% moyen complet

0,5

MDA-MB-231

Adénocarcinome mammaire (métastases)

humain

épithélial

adhérent

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

Support complet

0,5

ET 112

Carcinome à cellules transitionnelles de la vessie (primitif)

humain

épithélial

adhérent

85% - 90%

TrypLE

6 minutes + grattoir à cellules

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

Support complet

0,5

BFTC905

Carcinome à cellules transitionnelles de la vessie (primitif)

humain

épithélial

adhérent

75% - 85%

TrypLE

10 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

80 % milieu complet + 20 % PBS/EDTA 2 mM

0,5

J82

Carcinome à cellules transitionnelles de la vessie (primitif)

humain

épithélial

adhérent

85% - 90%

TrypLE

10 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

Support complet

0,5

RT4

Carcinome à cellules transitionnelles de la vessie (primitif)

humain

épithélial

adhérent

85% - 90%

TrypLE

6 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

Support complet

0,5

MIA PaCa-2

Carcinome épithéliode pancréatique (primitif)

humain

épithélial

adhérent

80% - 90%

TrypLE

3 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

60% FBS + 40% moyen complet

0,5

PANC-1

Carcinome épithéliode pancréatique (primitif)

humain

épithélial

adhérent

80%

TrypLE

5 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

PBS/EDTA 2mM

0,5

VC8

Fibroblastes pulmonaires, mutant BRCA2, hr-déficient

Hamster chinois

épithélial

adhérent

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

Support complet

0,25

VC8-B2

Fibroblastes pulmonaires, BRCA2 humain, BRCA2 −/− déficient en RH

Hamster chinois

épithélial

adhérent

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutes

Tube à microcentrifuge de 1,5 mL

Support complet

0,25

Tableau 1 : Confluence in vitro optimale pour l’injection de plusieurs lignées cellulaires

Colorant cellulaire

Numéro de catalogue

Spectre de fluorescence (Exc. - Em.)

Dilution du stock

Dilution de travail à la coloration dans un ballon

Dilution de travail à la coloration dans une microcentrifuge de 1,5 mL

Temps d’incubation

Observations

Vybrant CM-DiI

V22888

549 nm - 569 nm

Déjà dilué

4:1000 dans PBS 1x

4:1000 dans PBS 1x

15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC

Vybrant DiO

V22886

484 nm - 501 nm

Déjà dilué

5:1000 dans PBS 1x

5:1000 dans PBS 1x

15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC

Pas bonne résolution en imagerie confocale à 4 jours après l’injection

CellTracker Rouge profond

C34565

630 nm - 660 nm

1 mM en DMSO

0,5 à 2,5 μM dans pbs 1x

0,5 à 2,5 μM dans pbs 1x

15 min à 37 ºC

CellTracker Vert CMFDA

C7025

492 nm - 517 nm

10 mM en DMSO

0,5 à 2,5 μM dans pbs 1x

0,5 à 2,5 μM dans pbs 1x

15 min à 37 ºC

Fuites de produit dans la cavité abdominale 48 heures après l’injection, mais idéal pour les études de co-injection

Tableau 2 : Colorant et conditions

taille	Nombre de larves	E3 1x volume moyen
100 mm x 15 mm (standard)	Jusqu’à 50	20-25 mL
60 mm x 15 mm	Jusqu’à 20	10 mL
Plaque de 6 puits	Jusqu’à 15 par puits	3-4 mL par puits

Tableau 3 : Options de boîtes de Pétri

E3 medium 50x - stock	Pour 10 litres d’eau stérile:
	146,9 g de NaCl
	6,3 g de KCl
	24,3 g deCaCl2·2H2 O
	40,7 g deMgSO4·7H2O
E3 medium 1x – prêt à l’emploi	400 mL de milieu E3 50x
	60 mL de solution de bleu de méthylène à 0,01 %
	Remplissez jusqu’à 20 litres d’eau du système de pêche
Tricaine 25x – stock et euthanasie	2 g de poudre de tricaine
	500 mL d’eau osmosé inverse
	10 mL de Tris 1 M (pH 9)
	Ajuster au pH 7
Tricaine 1x - Anesthésie	20 mL de Tricaine 25x
	Remplir jusqu’à 500 mL d’eau du système
60 mg/mL Pronase - stock 100x	1 g de pronase
	16,7 mL d’eau stérile
0.6 mg/mL Pronase – 1x prêt à l’emploi	100 μL de pronase 100x
	9,9 mL de milieu E3 1x

Tableau 4 : Compositions en solution

Discussion

L’importance croissante du poisson zèbre comme modèle pour le développement du cancer et le dépistage des médicaments a donné lieu à de nombreuses publications^{3,4,7,13,14,16,18,19,20,21.} Cependant, l’injection de cellules cancéreuses dans des embryons de poissons zèbres est une technique qui nécessite un niveau élevé de dextérité qui peut être difficile pour les chercheurs. Dans ce protocole, nous visons à fournir des informations pratiques et quelques conseils qui peuvent aider à surmonter les défis initiaux de la mise en place de xénogreffes embryonnaires de poisson zèbre.

Manipulation cellulaire de l’injection antérieure
Ce protocole optimisé pour la génération de xénogreffes de poisson zèbre avec des lignées cellulaires peut être adapté à différents types de cellules (cancéreuses) avec différentes morphologies. Nous recommandons que toutes les lignées cellulaires utilisées pour les xénogreffes de poisson zèbre soient exemptes de mycoplasmes. Contrairement à d’autres contaminations bactériennes, la présence de mycoplasmes dans la culture cellulaire ne génère pas de changements qui peuvent être facilement détectés au microscope²². La contamination par mycoplasme peut affecter le potentiel de greffe des lignées cellulaires, leur sensibilité aux médicaments, ainsi que la viabilité des embryons de poisson zèbre.

Bien que les cellules puissent continuer à proliférer pendant une période prolongée, leur phénotype et leur génotype peuvent être sujets aux changements. Il est important de se familiariser avec la morphologie et le comportement des lignées cellulaires en culture. Nous vous recommandons de garder le nombre de passages cellulaires après décongélation entre 3 et 12 pour obtenir des résultats reproductibles. Ainsi, des tests réguliers de mycoplasme devraient être effectués.

Les cellules doivent être à leur phase logarithmique (phase de croissance exponentielle avant d’atteindre la confluence ~ 70%) le jour de l’injection. Ceci permettra à greffe proportionnée et au développement approprié des poinçons distinctifs de la tumeur. Pour prévenir la variation du phénotype des cellules dans la xénogreffe, il est essentiel de maintenir la confluence pour l’injection constante entre les expériences. Le nombre de cellules injectées peut être adapté aux caractéristiques de chaque lignée cellulaire, car certaines peuvent nécessiter des densités d’injection plus élevées pour prospérer dans les embryons de poisson zèbre.

Considérations relatives à l’étiquetage des cellules
Pour mieux visualiser les cellules tumorales humaines pour l’injection et l’analyse future, les cellules tumorales peuvent être marquées avec des colorants fluorescents. En raison des différences dans la taille cellulaire, le nombre total de cellules/cm² dans les cultures adhérentes varie selon les lignées cellulaires. Cela aura un impact sur l’efficacité du protocole de coloration ainsi que sur le nombre de cellules récoltées pour injection. Les grandes cellules qui produisent de faibles nombres par fiole (c.-à-d. Hs578T) ou qui poussent en grappes (c.-à-d. BFTC905) nécessiteront la mise en commun de plusieurs fioles pour une seule expérience. Dans ce cas, la coloration des cellules ne doit pas être effectuée directement dans le ballon car cela entraînera l’utilisation de quantités excessives de colorant (coût élevé). D’autre part, les cellules qui sont très sensibles aux cycles excessifs de centrifugation ainsi que celles qui donnent un nombre élevé par fiole (c’est-à-dire HCT116) peuvent être colorées directement dans le ballon, puis détachées avec de l’EDTA/racleur de cellules (pour plus d’informations, voir le tableau 1).

Dans la mesure du possible, au lieu d’utiliser une approche enzymatique, utilisez l’EDTA pour détacher les cellules le jour de l’injection, afin que les cellules récupèrent leurs jonctions cellule-cellule plus rapidement et soient soumises à moins d’étapes de centrifugation. Néanmoins, si les cellules sont sensibles à l’EDTA, très adhérentes ou se développent en grappes, une méthode enzymatique peut être appliquée. L’optimisation de la concentration idéale pour l’injection ainsi que du milieu d’injection dépend des caractéristiques de chaque lignée cellulaire, il pourrait donc nécessiter quelques ajustements(tableau 1).

Étalonnage des micro-injections
Contrairement à l’administration d’oligonucléotides ou de médicaments dans l’embryon de poisson zèbre, un graticule n’est pas utilisé pour calibrer l’aiguille lors du travail avec des lignées cellulaires pour les xénogreffes. Après un certain temps pendant l’injection, les cellules commenceront à se boucher et il est nécessaire de couper la pointe de l’aiguille pour augmenter son diamètre ou changer complètement l’aiguille. Cette procédure entrave l’étalonnage du graticule.

Pour résoudre ce problème, le nombre de cellules distribuées est régulé par la pression d’éjection et le temps nécessaire pour atteindre une taille similaire à l’œil embryonnaire en 1-3 impulsions. Ensuite, pour contrôler davantage la taille de la tumeur, à 1 dpi, les xénogreffes sont triées en fonction de la taille de la tumeur comme le montre la figure 6 B-B ». Comme représenté dans l’exemple de la figure 6C, cette méthode de tri est efficace pour réduire la variation des tailles de tumeurs : si nous les mettons toutes ensemble (+, ++, +++), le STEV est ~double de la classe ++ (~906 cellules à ~422 cellules) et la variation du coefficient est ~31,9% contre 14,5% dans la classe ++. Étant donné que la référence pour l’injection est le volume, le nombre total de cellules varie beaucoup entre les types de cellules - dépendant de la taille et de la forme des cellules. Par exemple, les grandes cellules avec beaucoup de cytoplasme comme le cancer du sein Hs578T, produisent des tumeurs beaucoup plus petites (~ 600 cellules). En outre, chaque lignée cellulaire nécessite un nombre différent de cellules. Par exemple, les lignées cellulaires du cancer de la vessie HT29 CRC et RT112 ont montré que plus le nombre de cellules injectées est élevé, plus la mortalité du poisson zèbre est élevée. Par conséquent, une période d’optimisation lors du développement des xénogreffes est nécessaire pour tester si la lignée cellulaire a des effets toxiques dans l’embryon ou nécessite des densités d’injection plus élevées / plus faibles.

Site d’injection
L’une des anomalies les plus courantes lors de la génération de xénogreffes embryonnaires de poisson zèbre est le site d’injection. Le jaune est généralement le lieu de choix pour l’injection en raison de son accessibilité facile. Cependant, nous avons observé que les cellules injectées dans le jaune ont une plus grande tendance à mourir. Bien que techniquement plus difficile, nous recommandons d’injecter dans le PVS et aussi loin que possible du cœur. Au sein du PVS, les cellules peuvent s’agréger, recruter des vaisseaux et des cellules immunitaires, et migrer, invaser, extravaser et former une microméthastasie, si elles présentent des caractéristiques métastatiques^8,11.

Efficacité de la greffe
Des différences dans l’efficacité de greffe et la taille de tumeur parmi des variétés de cellule à 4 dpi sont prévues en raison de leurs degrés distincts de mort/survie/prolifération de cellules basiques mais aussi en raison de l’immunogénicité innée que chaque variété de cellule peut afficher^9.

métastase
La métastase comprend une cascade en plusieurs étapes d’événements qui peuvent être divisés en deux étapes arbitraires. Dans la première étape, les cellules tumorales doivent se détacher du site primaire, migrer et envahir les tissus adjacents, puis s’infiltrer dans la circulation sanguine. Dans un deuxième temps, les cellules tumorales doivent survivre en circulation, s’extravaser du sang ou des vaisseaux lymphatiques, et enfin coloniser sur des sites secondaires^23. Pour distinguer ces événements tôt et tard et adresser le potentiel/la compétence des différentes cellules de tumeur pour exécuter ces étapes, nous avons conçu un essai simple.

En général, lorsqu’elles sont injectées dans le SPV, les cellules tumorales peuvent entrer directement en circulation, puis être piégées physiquement dans le tissu hématopoïétique caudal (CHT) (région de la queue). Cependant, selon les caractéristiques de chaque cellule tumorale - nous avons vu que certaines cellules tumorales restent au CHT 4 dpi et sont capables de former une microméthastasie tandis que d’autres cellules tumorales disparaissent (effacées après avoir été attrapées dans le CHT).

Par conséquent, en comparant l’efficacité de la microméthastasie (à 4 dpi) lorsque les cellules ont été placées directement dans la circulation - CIRC (les cellules n’ont qu’à passer par les étapes tardives de la métastase) vs. quand non - PAS de CIRC (les cellules doivent passer par des étapes précoces et tardives pour pouvoir former une microméthastasie), nous pouvons évaluer leur potentiel métastatique précoce ou tardif. Nous avons observé des cellules tumorales qui peuvent former efficacement une microméthastasie dans le CHT dans les deux groupes (CIRC et NO CIRC), ce qui suggère que ces cellules ont la capacité de subir toutes les étapes de la cascade métastatique (SW480 et MDA-MB-468 par exemple)^8,11. En revanche, d’autres cellules tumorales ont un très faible potentiel métastatique dans les deux groupes, ne faisant presque jamais de microméthastasie, même lorsqu’elles sont injectées dans la circulation (c’est-à-dire visibles dans le CHT à 24 hpi, mais à 4 dpi elles ne sont plus là, Hs578T par exemple)⁸. Cependant, nous avons clairement trouvé un autre groupe - celui qui n’est capable de former une microméthastasie que lorsqu’il est injecté dans la circulation (nous ne pouvons observer la microméthastasie que dans le groupe CIRC). Ceci suggère que ces cellules ont une faible efficacité en exécutant les premières étapes de la cascade métastatique mais d’autre part sont capables de survivre dans la circulation, extravasate et coloniser un site éloigné.

Immunomarquage et imagerie
Avant la fixation, ce protocole d’injection peut être utilisé pour d’autres approches d’imagerie en direct comme la microscopie à contraste différentiel d’interférence différentiel (DIC) en direct, la microscopie à disque tournant, l’imagerie confocale en direct à haute résolution et la microscopie à feuille de lumière, etc.

Les cellules mortes et les débris cellulaires apparaissent brillants lorsqu’ils sont observés à travers le stéréomicroscope fluorescent et peuvent être confondus avec des cellules vivantes, en particulier si le but de l’étude est d’évaluer le potentiel métastatique des lignées cellulaires. Nous voudrions souligner l’importance d’exécuter la formation image confocale avec les marqueurs spécifiques de viabilité et DAPI pour évaluer l’état de survie de la tumeur et du micrometastasis. En outre, il est fondamental d’utiliser des anticorps humains spécifiques pour détecter les cellules humaines telles que les mitochondries anti-humaines ou le HLA anti-humain. Lors de la mise en œuvre du protocole, entraînez les yeux des expérimentateurs en comparant la coloration dans le stéréomicroscope avec les images confocales. Après un certain temps, les expérimentateurs peuvent clairement distinguer les débris des cellules vivantes dans le stéréomicroscope fluorescent.

Bien que d’autres méthodes pour quantifier le fardeau de tumeur tel que le secteur entier de fluorescence soient employées couramment, nous recommandons d’exécuter l’immunomarquage entier de montage et la formation image confocale comme méthode plus précise. Non seulement l’efficacité de la coloration des colorants lipophiles est très variable (c’est-à-dire que certaines cellules sont très bien colorées tandis que d’autres ne sont pas probablement dues à la teneur en lipides de leurs membranes), mais aussi plusieurs fois les colorants lipophiles forment des agrégats, et les cellules mortes ont tendance à être plus brillantes - créant plusieurs artefacts qui peuvent être confondus avec des cellules vivantes.

Les cellules peuvent être transduites avec des protéines fluorescentes pour faciliter leur suivi et pour éviter l’étiquetage des cellules. Cependant, assurez-vous que les cellules transduites et non transduites produisent les mêmes résultats dans les xénogreffes de poisson zèbre.

En outre, les macrophages peuvent phagocyter ces débris de cellules fluorescentes devenant fluorescentement marqués et migrer, générant des cellules métastatiques faussement positives. Ainsi, nous recommandons une série d’outils analytiques, qui bien sûr peuvent être étendus à de nombreuses autres lectures pour une interprétation plus précise du comportement tumoral:

• Prolifération - quantification des figures mitotiques avec DAPI ou anticorps anti-pHH3^Ser10 (Merck Millipore Cat. #06-570),
• Mort cellulaire par apoptose- anticorps anti-activé Caspase3^Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) ou équivalent,
• Taille de la tumeur - comptage DAPI - les cellules tumorales humaines montrent une organisation de la chromatine très distincte, de sorte qu’elles se distinguent facilement des cellules du poisson zèbre et qu’il est toujours possible de vérifier avec le colorant (lorsque vous entraînez votre œil),
• Pour les études métastatiques, pour détecter sans ambiguïté les cellules humaines, - HLA anti-humain (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), mitochondries anti-humaines (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).

Pour une acquisition confocale avec un intervalle de 5 μm entre les tranches de la pile Z des cellules cancéreuses témoins HCT116 (taille nucléaire moyenne de 10-12 μm de diamètre) avec contre-altération DAPI, nous avons observé qu’environ 50% des cellules sont partagées entre deux tranches consécutives. Par conséquent, si chaque tranche est comptée, il existe un risque élevé de compter les mêmes cellules deux fois. Faire des allers-retours entre les tranches pour éviter les problèmes de quantification entraîne une technique longue et sujette aux erreurs. Pour faciliter la quantification du nombre total de cellules et permettre plus de reproductibilité entre chercheurs, nous avons créé la formule de taille de tumeur précédemment décrite dans ce protocole^8.

Nous avons inclus un numéro de correction (1,5) pour tenir compte des cellules ~ 50% partagées entre les tranches. Nous avons constaté que l’erreur moyenne de comptage manuel de la tumeur entière entre les chercheurs était de 20%. Deux chercheurs utilisant la formule ont eu une erreur de 2%. L’utilisation de cette formule a un taux de précision de 93% et un taux de reproductibilité de 98%. Nous avons également testé des méthodes automatisées, mais elles ont démontré une erreur supérieure à 50% causée par les paramètres de seuil.

En raison des caractéristiques des cellules apoptotiques, la quantification des cellules de caspase 3 activées est plus difficile. Pour réduire le nombre d’erreurs et la variation des résultats, nous recommandons que les échantillons témoins et expérimentaux soient comptés par le même chercheur. De plus, lorsqu’il apprend cette technique, un nouveau chercheur doit compter les images qui ont déjà été quantifiées par des chercheurs plus expérimentés pour comparer les résultats et se former.

La durée du test peut être prolongée si nécessaire. Cependant, il est important de considérer que les larves de poissons zèbres ont besoin d’une alimentation vivante à partir d’environ 7 jours après la fécondation (5 jours après l’injection). De plus, les lignes directrices et les règlements sur le bien-être des animaux appliqués aux larves âgées de plus de 6 jours après la fécondation peuvent varier.

Ce protocole fournit des outils utiles pour permettre à un seul chercheur d’injecter environ 200 à 300 larves de poissons zèbres par heure; et les résultats de l’essai complet, y compris l’analyse et l’interprétation statistique, obtenus en trois semaines. Nous espérons que ce protocole pourra aider les chercheurs à devenir des experts dans la génération de xénogreffes de poisson zèbre. Ce n’est pas facile; vous devez pratiquer, mais vous y arriverez. Bonne chance!

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar for bacteriology	VWR	97064-336	Agar plate
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)	Cell Signalling Technologies	9661	Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)
anti-human HLA (Rabbit monoclonal)	Abcam EP1395Y	ab52922	Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)
anti- 488 (Rabbit monoclonal)	ThermoFisher Scientific	35552	Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)
anti- 594 (Rabbit monoclonal)	ThermoFisher Scientific	35560	Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)
CellTracker Deep Red Dye	ThermoFisher Scientific	C34565	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
CellTracker Green CMFDA Dye	ThermoFisher Scientific	C2925	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
Conical Centrifuge tube 50mL	VWR	525-0610
Conical Centrifuge tube 15mL	VWR	525-0604
DAPI			Nuclear and chromosome counterstain
Laser-Based Micropipette Puller P-2000	Sutter-Instrument		Micropipette Puller
Microcentrifuge tube 1.5mL	Abdos	P10202
Microscope slides, cut edge	RS France	BPB016	Slides for mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Mounting medium
Pneumatic Picopump	World Precision Instruments	PV820	Microinjector
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	ThermoFisher Scientific	631-9430	Coverslips for mounting
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004	Agar plate
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100-4	Borosilicate capillaries
TrypLE	Gibco	12605036	Enzymatic detachment solution
Vaseline			Petroleum jelly for slide sealing
Vybrant CM-DiI Dye	ThermoFisher Scientific	V22888	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	ThermoFisher Scientific	V22886	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology	ZEISS		Fluorescence Stereo Zoom Microscope
Zeiss LSM 710	ZEISS		Confocal microscope