Analyse de la constante de ressort moléculaire par spectroscopie de sonde de force de biomembrane

Résumé

Une sonde de force biombrane (BFP) est une technique de spectroscopie de force dynamique (DFS) in situ. BFP peut être utilisé pour mesurer la constante de ressort des interactions moléculaires sur les cellules vivantes. Ce protocole présente une analyse de la constante de ressort pour les liaisons moléculaires détectées par BFP.

Résumé

Une sonde de force biomébrarane (BFP) a récemment émergé en tant que nanooutil de spectroscopie de force dynamique (DFS) à surface cellulaire native ou in situ qui peut mesurer la cinétique de liaison moléculaire unique, évaluer les propriétés mécaniques des interactions ligand-récepteur, visualiser les changements conformationnels dynamiques des protéines et élucider de manière plus excitante les mécanismes de mécanosension cellulaire médiés par les récepteurs. Plus récemment, le BFP a été utilisé pour mesurer la constante de ressort des liaisons moléculaires. Ce protocole décrit la procédure étape par étape pour effectuer une analyse DFS de la constante de ressort moléculaire. Plus précisément, deux modes de fonctionnement BFP sont discutés, à savoir les modes Bead-Cell et Bead-Bead. Ce protocole se concentre sur la dérivation des constantes de ressort de la liaison moléculaire et de la cellule à partir de données brutes DFS.

Introduction

En tant que technique DFS à cellules vivantes, BFP conçoit un globule rouge humain (RBC; Figure 1) dans un transducteur de force ultrasensible et accordable avec une plage constante de ressort compatible à 0,1-3 pN/nm^1,2,3. Pour sonder l’interaction ligand-récepteur, BFP permet des mesures DFS à ~1 pN^{(10 -12} N), ~3 nm^{(10 -9} m) et ~0,5 ms (10^-3 s) en force, résolution spatiale et temporelle^4,5. Sa configuration expérimentale se compose de deux micropipettes....

Protocole

1. Obtenir des événements DFS analysables

1. Démarrez l’expérience dans le logiciel (par exemple, LabVIEW VI) pour le contrôle BFP et le réglage des paramètres (Figure S1A).
2. Observez les touches répétitives perles cibles de perles/cellules de la sonde dans le logiciel pour BFP Monitor (Figure S1B).
3. Testez et atteignez la fréquence d’adhérence ≤ 20% dans les 50 premières touches en réglant la force d’impingement et le temps de contact, ce qui garantit que ≥ 89% de l’événement d’adhérence DFS sont médiées par des liaisons simples^12,13,

Résultats

Dans ce travail, nous avons démontré le protocole de l’analyse constante du ressort BFP. Pour le mode d’analyse Bead-Cell, nous avons analysé le k_mol de la liaison moléculaire entre la protéine glycosylé Thy-1 enrobée sur la perle de la sonde et l’intégrine α₅β₁ exprimée sur la cellule Cible K562 (Thy-1-intégrine α₅β₁; Figure 3A) ¹⁰. La_cellule kest également déri.......

Discussion

En résumé, nous avons fourni un protocole d’analyse de données détaillé pour le prétraitement des données brutes DFS et la dérivation des constantes de ressort moléculaire dans les modes d’analyse BFP Bead-Bead et Bead-Cell. Des modèles biomécaniques et des équations nécessaires à la détermination des constantes de ressort moléculaires et cellulaires sont présentés. Bien que différentes intégrines soient étudiées, le k_mol mesuré par le mode Perle-Perle et le mode Perle-Cellu.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)	Uct, Specialties, llc	4420-74-0	Glass bead functionalization
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Phosphate buffer preparation
BFP data acquisition VI	LabVIEW		BFP control and parameter setting
BFP data analysis VI	LabVIEW		BFP raw data analysis
Biotin-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	RBC biotinylation
Borosilicate Glass beads	Distrilab Particle Technology, Netherlands	9002	Glass bead functionalization
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A0336	Ligand functionalization
Camera VI	LabVIEW		BFP monitoring
D-glucose	Sigma-Aldrich	G7021	Tyrode’s buffer preparation
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode’s buffer preparation
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Glass bead functionalization
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tyrode’s buffer preparation
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Carbonate/bicarbonate buffer preparation
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tyrode’s buffer preparation
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Phosphate buffer preparation
Streptavidin-Maleimide	Sigma-Aldrich	S9415	Glass bead functionalization