Régulation mésenchymateuse des cellules souches de la phagocytose des macrophages; Quantification et imagerie

Résumé

Présenté ici est un protocole pour quantifier et produire des images dynamiques de la régulation médiée par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la phagocytose des macrophages (MΦ) des particules de levure non opsonisées (zymosan) qui sont conjuguées à une molécule fluorescente sensible au pH.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont traditionnellement été étudiées pour leurs propriétés régénératrices, mais plus récemment, leurs caractéristiques immunorégulatrices ont été à l’avant-garde. Ils interagissent avec et régulent l’activité des cellules immunitaires. L’objectif de cette étude est la régulation MSC de l’activité phagocytaire des macrophages. La phagocytose des macrophages (MΦ) est une partie importante de la réponse du système immunitaire inné à l’infection, et les mécanismes par lesquels les CSM modulent cette réponse sont à l’étude active. Présenté ici est une méthode pour étudier la phagocytose MΦ de particules de zymosan non opsonisées conjuguées à une molécule fluorescente sensible au pH en co-culture avec MSC. À mesure que l’activité phagocytaire augmente et que les particules de zymosan marquées sont enfermées dans l’environnement acide du phagolysosome, l’intensité de fluorescence de la molécule sensible au pH augmente. Avec les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées, l’activité phagocytaire est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre fluorescent et les données cinétiques sont présentées sous forme de changements dans les unités fluorescentes relatives sur une période de 70 minutes. Pour étayer ces données quantitatives, le changement de l’activité phagocytaire est visualisé à l’aide de l’imagerie dynamique. Les résultats utilisant cette méthode démontrent que lorsqu’ils sont en co-culture, les CSM améliorent la phagocytose MΦ du zymosan non opsonisé de MΦ naïf et γ traité par IFN. Ces données s’ajoutent aux connaissances actuelles sur la régulation MSC du système immunitaire inné. Cette méthode peut être appliquée dans de futures recherches pour délimiter complètement les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules progénitives qui donnent naissance à des cellules du tissu conjonctif. Les CSM sont présents dans les tissus des mammifères adultes et peuvent être isolés de la moelle osseuse¹. En raison de leurs propriétés immunomodulatrices, ces cellules sont largement étudiées². Les premières études se sont concentrées sur la régulation MSC des lymphocytes T^3,4,^5,6 mais plus récemment, leur régulation des cellules macrophages (MΦ), un composant c....

Protocole

REMARQUE: Toutes les techniques de préparation du milieu et de culture cellulaire sont effectuées dans des conditions aseptiques à l’aide d’une armoire de biosécurité à flux laminaire. Toutes les étapes d’incubation de culture décrites sont réalisées à l’aide d’un incubateur conçu pour maintenir une atmosphère de 37 °C, 5 % de CO₂et 95 % d’humidité.

1. Culture cellulaire

1. Préparation du milieu de croissance
   1. Pour le MSC et le LADMAC, ajouter 50 mL de FBS et 5 mL de mélange antibiotique/antimycotique 100x à 500 mL de DMEM à haute teneur en glucose.
   2. Pour le MΦ, ajouter 50 mL de FBS, 100 mL de milieu de co....

Résultats

Après avoir calculé la moyenne ± SEM pour chaque groupe à tous les points temporels, les données sont présentées sous forme de graphique linéaire avec l’axe Y comme intensité fluorescente relative et l’axe X comme temps. Le fichier supplémentaire 1 fournit un exemple de données brutes provenant d’une lecture cinétique de la plaque de 96 puits dans un format de feuille de calcul.

Dans cette étude, les résultats optimaux présentés à la

Discussion

L’analyse de la phagocytose à l’aide de bioparticules conjuguées à un colorant sensible au pH est un outil relativement nouveau qui s’est avéré avantageux par rapport aux particules traditionnelles étiquetées par fluorescence^12,19,20. Avec les particules traditionnelles étiquetées par fluorescence, seule l’analyse du point final est réalisable. La détection est effectuée par microscopie fluorescente et/ou spe.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Black Polystyrene Microplate	MilliporeSigma	CLS3603-48EA
0.4% trypan blue solution	MilliporeSigma	T8154-20ML
15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher	339653
4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells	ThermoFisher	155382PK
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco	ThermoFisher	15240096
Axiobserver 7 Imaging System	Zeiss
Bovine Serum Albumin (BSA)	MilliporeSigma	A8806-1G
Cell lifter	MilliporeSigma	CLS3008-100EA
Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered	MilliporeSigma	C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]	ATCC	CRL-12424	Mouse MSC Cell Line
DMEM, High Glucose	ThermoFisher	11965092
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Hemocytometer	FisherScientific	02-671-51B
I-11.15	ATCC	CRL-2470	Mouse MΦ Cell Line
LADMAC Cell Line	ATCC	CRL-2420	LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).
Live-Cell Imaging solution	ThermoFisher	A14291DJ
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010031
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate	ThermoFisher	P35365
Recombinant Murine IFN-γ	Preprotech	315-05
Spectramax i3X	Molecular Devices
Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm	ThermoFisher	568-0020
Sterile syringe filters, 0.2 micrometer	ThermoFisher	723-2520
Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm	MilliporeSigma	CLS430167-100EA
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher	25300054