Génération d’organoïdes cérébraux humains pour la modélisation des maladies mitochondriales

Résumé

Nous décrivons un protocole détaillé pour la génération d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leur utilisation dans la modélisation des maladies mitochondriales.

Résumé

Les maladies mitochondriales représentent la plus grande classe d’erreurs innées du métabolisme et sont actuellement incurables. Ces maladies provoquent des anomalies neurodéveloppementales dont les mécanismes sous-jacents restent à élucider. Un obstacle majeur est le manque de modèles efficaces récapitulant la déficience neuronale précoce observée chez les patients. Les progrès de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) permettent la génération d’organoïdes cérébraux tridimensionnels (3D) qui peuvent être utilisés pour étudier l’impact des maladies sur le développement et l’organisation du système nerveux. Les chercheurs, y compris ces auteurs, ont récemment introduit des organoïdes cérébraux humains pour modéliser les troubles mitochondriaux. Cet article présente un protocole détaillé pour la génération robuste d’organoïdes cérébraux humains dérivés de l’iPSC et leur utilisation dans le profilage bioénergétique mitochondrial et les analyses d’imagerie. Ces expériences permettront l’utilisation d’organoïdes cérébraux pour étudier les dysfonctionnements métaboliques et développementaux et peuvent fournir des informations cruciales pour disséquer la pathologie neuronale des maladies mitochondriales.

Introduction

Les maladies mitochondriales représentent la plus grande classe d’erreurs innées du ^{métabolisme1}. Ils sont causés par des mutations génétiques perturbant différents processus mitochondriaux, y compris la phosphorylation oxydative (OXPHOS)², l’assemblage de la chaîne respiratoire, la dynamique mitochondriale et la transcription ou la réplication de l’ADN ^{mitochondrial3}. Les tissus ayant des besoins énergétiques sont particulièrement affectés par le dysfonctionnement ^{mitochondrial4}. En conséquence, les patients atteints de maladies mitochondriales développent généralement des....

Protocole

REMARQUE: L’utilisation de CSPi humaines peut nécessiter une approbation éthique. Les CSPi utilisées dans cette étude ont été dérivées de personnes témoins en bonne santé après approbation éthique locale (#2019-681). Toutes les procédures de culture cellulaire doivent être effectuées sous une hotte de culture cellulaire stérile, en désinfectant soigneusement tous les réactifs et consommables avant de les transférer sous le capot. Les CSPi humaines utilisées pour la différenciation devraient avoir un nombre de passage inférieur à 50 pour éviter les aberrations génomiques potentielles qui pourraient se produire lors d’une culture extensive. L’état pluripotent des cellul....

Résultats

Le protocole décrit ici facilite la génération robuste d’organoïdes ronds (Figure 1A). Les organoïdes générés contiennent des neurones matures qui peuvent être visualisés à l’aide de marqueurs protéiques spécifiques aux axones (SMI312) et aux dendrites (protéine 2 associée aux microtubules (MAP2)) (Figure 1B).. Les organoïdes matures contiennent non seulement des cellules neuronales (MAP2-pos.......

Discussion

Cet article décrit la génération reproductible d’organoïdes cérébraux humains dérivés de l’iPSC et leur utilisation pour la modélisation des maladies mitochondriales. Le protocole décrit ici est modifié sur la base d’un travail précédemment ^publié20. Un avantage majeur du protocole actuel est qu’il ne nécessite pas l’intégration manuelle de chaque organoïde dans une matrice d’échafaudage. En fait, la solution matricielle est simplement dissoute dans le milieu de cultu.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	31350-010
Affinity Designer	Serif (Europe) Ltd		Layout software; Vector graphics editor
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig	Sigma Aldrich	SAB4600033-250UL	1:300
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-31571	1:300
Antimycin A	Sigma Aldrich	1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)	Sigma Aldrich	T8578	1:2000
Argon Laser	Melles Griot		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too
Ascorbic acid	Sigma	A92902
B-27 with Vitamin A	Gibco	17504044
Bacto Agar	Becton Dickinson		3% in PBS, store solution at -20 °C
BDNF	Miltenyi Biotec	130-093-0811
cAMP	Sigma	D0627
Cell Star cell culture 6 well plate	Greiner-Bio-One	657160
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031
Confocal laser scanning microscope C1	Nikon Microscope Solutions		Modular confocal microscope system
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231	Matrix component
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher	C7026
DMEM/F12	ThermoFisher	31330038
DMSO	Sigma	D2660-100ML
Donkey anti-goat Cy3	Merck Millipore	AP180C	1:300
Donkey anti-mouse Cy3	Merck Millipore	AP192C	1:300
Donkey anti-rabbit Cy3	Merck Millipore	AP182C	1:300
DPBS	Gibco	14190250
DS-Q1Mc camera	Nikon Microscope Solutions
Eclipse 90i upright widefield microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN upright microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 Inverted Microscope	Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91	Nikon Microscope Solutions		Imaging software for confocal microscope
FCCP	Sigma Aldrich	370-86-5
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-291
Glasgow MEM	Gibco	11710-035
Glass Pasteur pipette	Brand	747715	Inverted
Glutamax	Gibco	35050-061
Helium-Neon Laser	Melles Griot		Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too
Heparin	Merck	H3149-25KU
HERACell 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	1:2500
Image J 1.53c	Wayne Rasband National Institute of Health		Image processing Software
Injekt Solo 10 mL/ Luer	Braun	4606108V
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828010
Laser (407 nm)	Coherent		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too
Map2	Synaptic Systems	No. 188004	1:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAA	Gibco	11140-050
mTeSR Plus	Stemcell Technology	85850	iPSC medium
Multifuge X3R Centrifuge	Thermo Scientific	10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	# LT07-218
N2 Supplement	Gibco	17502-048
Needle for single usage (23G x 1” TW)	Neoject	10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2	Nikon		Imaging software
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00
PAP Pen	Sigma	Z377821-1EA	To draw hydrophobic barrier on slides.
Papain Dissociation System kit	Worthington	LK003150
Paraformaldehyde	Merck	818715	4% in PBS, store solution at -20 °C
Pasteur pipette 7mL	VWR	612-1681	Graduated up to 3 mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0	Nikon Microscope Solutions		Dry Microscope Objective
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13	Nikon Microscope Solutions		Oil Immersion Microscope Objective
Polystyrene Petri dish (100 mm)	Greiner Bio-One	664161
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)	Falcon	352235
Potassium chloride	Roth	6781.1
ProLong Glass Antifade Moutant	Invitrogen	P36980
Qualitative filter paper	VWR	516-0813
Rock Inhibitior	Merck	SCM075
Rotenone	Sigma	83-794
S100β	Abcam	Ab11178	1:600
SB-431542	Cayman Chemical Company	13031
Scalpel blades	Heinz Herenz Hamburq	1110918
SMI312	Biolegend	837904	1:500
Sodium bicarbonate	Merck/Sigma	31437-1kg-M
Sodium chloride	Roth	3957
Sodium dihydrogen phosphate	Applichem	131965
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
SOX2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-17320	1:100
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco/StemPro	A1110501	Reagent A
Super Glue Gel	UHU	63261	adhesive gel
SuperFrost Plus	VWR	631-0108
Syringe for single usage (1 mL)	BD Plastipak	300015
TB2 Thermoblock	Biometra
TC Plate 24 Well	Sarstedt	83.3922
TC Plate 6 Well	Sarstedt	83.392
TGFbeta3	Miltenyi Biotec	130-094-007
Tissue Culture Hood	ThermoFisher	51032711
TOM20	Santa Cruz Biotechnology	SC-11415	1:200
Triton-X	Merck	X100-5ML
UltraPure 0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
Vibratome Microm HM 650 V	Thermo Scientific		Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.
Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade	Wilkinson Sword	70517470
Whatman Benchkote	Merck/Sigma	28418852
Wnt Antagonist I	EMD Millipore Corp	3378738
XF 96 extracellular flux analyser	Seahorse Bioscience	100737-101
XF Assay DMEM Medium	Seahorse Bioscience	103680-100
XF Calibrant Solution	Seahorse Bioscience	100840-000
XFe96 FluxPak (96-well microplate)	Seahorse Bioscience	102416-100