Construction de membranes lipidiques modèles incorporant des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)

Résumé

Ce protocole utilise le gonflement de l’agarose comme une technique puissante et généralisable pour incorporer des protéines membranaires intégrales (PIM) dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (GUV), comme décrit ici pour la reconstitution de la protéine réceptrice de la sérotonine 1A humaine (_5-HT1AR), l’une des classes de récepteurs couplés à la protéine G pharmacologiquement importants.

Résumé

Des recherches in vitro robustes sur la structure et la fonction des protéines membranaires intégrales ont été un défi en raison de la complexité de la membrane plasmique et des nombreux facteurs qui influencent le comportement des protéines dans les cellules vivantes. Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont un système de modèle in vitro biomimétique et hautement accordable pour étudier les interactions protéine-membrane et sonder le comportement des protéines d’une manière précise et dépendante du stimulus. Dans ce protocole, nous présentons une méthode peu coûteuse et efficace pour fabriquer des GUV avec le récepteur humain de la sérotonine 1A (_5-HT1AR) intégré de manière stable dans la membrane. Nous fabriquons des GUV en utilisant une méthode de gonflement d’hydrogel modifiée; en déposant un film lipidique sur un mélange d’agarose et de _5-HT1AR puis en hydratant l’ensemble du système, des vésicules peuvent être formées avec du _5-HT1AR correctement orienté et fonctionnel incorporé dans la membrane. Ces GUV peuvent ensuite être utilisés pour examiner les interactions protéine-membrane et le comportement de localisation par microscopie. En fin de compte, ce protocole peut faire progresser notre compréhension de la fonctionnalité des protéines membranaires intégrales, fournissant un aperçu physiologique profond.

Introduction

Les membranes modèles synthétiques sont des outils puissants dans l’étude des propriétés et des fonctions fondamentales des biomembranes. Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont l’une des plates-formes les plus importantes pour étudier une variété de propriétés de la membrane plasmique et peuvent être conçues pour imiter différentes conditions physiologiques1,2,3,4,5,6,7,8. Il est bien établi que....

Protocole

1. Marquage des protéines

1. Laissez le NHS-Rhodamine, les fragments de membrane _5-HT1A et une colonne de dessalement de spin de 7 K MWCO s’équilibrer à température ambiante.
2. Dissoudre 1 mg de NHS-rhodamine dans 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
3. Ajouter 5 μL de solution de bicarbonate de sodium 1 M pour augmenter le pH de la solution _5-HT1AR à pH 8.
4. Ajouter 3,66 μL de la solution de NHS-rhodamine à 50 μL de la solution _5-HT1AR et pipeter doucement de haut en bas dans un tube de microcentrifugation.
   REMARQUE: Assurez-vous d’avoir au moins 10x l’excès molaire de NHS-rhodamine.
5. Gardez le....

Résultats

La concentration de protéines a été mesurée et le degré de marquage a été calculé comme le rapport molaire entre le colorant et la protéine étant de 1:1. En examinant les GUV à l’aide de la microscopie confocale, nous avons pu confirmer la formation réussie et l’intégration protéique des vésicules. Les lipides ont été marqués avec 0,4 mol% d’ATTO 488-DPPE, et la protéine a été marquée de manière covalente via la modification de l’ester NHS de rhodamine des amines primaires.

Discussion

Nous avons identifié deux étapes essentielles au succès du protocole global: le traitement au plasma et le dépôt de lipides. Le nettoyage au plasma des couvercles est essentiel pour assurer une couverture et une adhérence adéquates de l’hydrogel d’agarose sur le couvercle en verre. Le nettoyage au plasma accomplit deux choses: premièrement, il élimine les traces de matière organique de la surface du verre; deuxièmement, il active la surface du couvercle, ce qui permet une augmentation de la mouillabilité .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850375C-25mg
TI-Eclipse inverted microscope	Nikon, Melville, NY	Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings	Sterling Seal & Supply, Neptune, IN	5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera	Photometrics, Huntington Beach, CA	Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm	Coherent, Santa Clara, CA	488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments	Perkin Elmer, Waltham, MA	RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)	ATTO-TEC, Siegen, Germany	AD 488-155
Bench top plasma cleaner	Harrick Plasma, Ithaca, NY	PDC-32G
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A9418
chloroform (CHCl3)	Millipore Sigma, Burlington, MA	CX1055
Cholesterol (Chol)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom	Corning, Corning, NY	3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic	Elma, Singen, Germany	[no longer sold on main website]
glucose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G7528
methanol (MeOH)	Millipore Sigma, Burlington, MA	MX0485
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	ND-1000
NHS-Rhodamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)	Corning, Corning, NY	21-040
spinning-disc CSUX confocal head	Yokogawa,Tokyo, Japan	CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips	ChemGlass, Vineland, NJ	CLS-1760
sucrose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	S7903
Sykes-Moore chambers	Bellco, Vineland, NJ	1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5030
VWR Analog Heatblock	VWR International, Radnor, PA	[no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator	VWR International, Radnor, PA	10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	89882