Quantification de la concurrence interbactérienne à l’aide de l’imagerie par fluorescence unicellulaire

Résumé

Ce manuscrit décrit une méthode d’utilisation de la microscopie à fluorescence unicellulaire pour visualiser et quantifier la compétition bactérienne en coculture.

Résumé

La compétition interbactérienne peut avoir un impact direct sur la structure et la fonction des microbiomes. Ce travail décrit une approche de microscopie à fluorescence qui peut être utilisée pour visualiser et quantifier les interactions concurrentielles entre différentes souches bactériennes au niveau d’une seule cellule. Le protocole décrit ici fournit des méthodes pour des approches avancées dans la préparation de lames sur des microscopes à épifluorescence verticale et inversée, des techniques d’imagerie à cellules vivantes et en accéléré, et l’analyse quantitative d’images à l’aide du logiciel open source FIJI. L’approche de ce manuscrit décrit la quantification des interactions compétitives entre les populations symbiotiques de Vibrio fischeri en mesurant le changement de surface au fil du temps pour deux souches co-co-co-frappées qui expriment différentes protéines fluorescentes à partir de plasmides stables. D’autres méthodes sont décrites pour optimiser ce protocole dans les systèmes de modèles bactériens qui nécessitent des conditions de croissance différentes. Bien que le test décrit ici utilise des conditions optimisées pour V. fischeri,cette approche est hautement reproductible et peut facilement être adaptée pour étudier la concurrence entre les isolats cultivables de divers microbiomes.

Introduction

Cet article décrit une méthode de quantification de la compétition bactérienne au niveau d’une seule cellule à l’aide de la microscopie à fluorescence. La structure et la fonction des communautés microbiennes sont souvent façonnées par des interactions concurrentielles entre microbes, et dans de nombreux cas, la caractérisation de ces interactions nécessite l’observation de différentes souches bactériennes en co-co-lubration^1,2,3,4,^5,6,7,8 . Traditionnellement, la compétition bactérienne est quantifiée au niveau de la population en comptant les unités formant des colonies (UFC) des souches inhibitrices et cibles avant et après une période de co-co-lubration^2,9. Les mécanismes de compétition microbienne sont largement répartis entre les bactéries et peuvent s’appuyer sur la diffusion ou le contact cellule-cellule pour inhiber les cellules cibles^10,11,12,13,^14,15,16^,17,18,19.

Bien que des souches bactériennes soient souvent observées en co-co-cocuation au niveau de la population, ce manuscrit décrit un test pour la quantification unicellulaire de la compétition bactérienne. En outre, ce travail comprend des suggestions pour adapter le protocole pour l’utilisation avec d’autres espèces bactériennes. Bien que les techniques spécifiques de cet article soient utilisées pour étudier la compétition intraspécifique dépendante du contact entre les souches de la bactérie symbiotique Vibrio fischeri^20,21,22, elles peuvent être adaptées à la compétition entre de nombreux organismes. Cet article fournit des instructions pour la configuration des lames sur les microscopes verticaux et inversés, et toutes les analyses sont décrites à l’aide du logiciel open source FIJI²³ afin que la méthode puisse être utilisée par les chercheurs ayant accès à différentes configurations d’imagerie et programmes d’analyse. Compte tenu de l’importance d’étudier la compétition microbienne à la fois au niveau de la population et au niveau des cellules uniques, cette méthode sera une ressource précieuse pour les chercheurs afin de quantifier les interactions concurrentielles, en particulier ceux qui n’ont pas accès à un logiciel d’analyse propriétaire.

Protocole

1. Optimisation des souches bactériennes

1. Choisissez deux souches bactériennes pour les tests de compétition bactérienne unicellulaire. Ici, deux souches de V. fischeri sont utilisées: une souche cible (ES114²⁴) et une souche inhibitrice (MJ11²⁵) qui est connue pour tuer la souche cible en utilisant le système de sécrétion de type VI sur le chromosome II (T6SS2)¹, qui est un mécanisme de destruction dépendant du contact.
2. Déterminez les contrôles appropriés pour l’expérience. Dans cet exemple, le contrôle approprié consiste à incuber les souches inhibitrices mutantes de type sauvage et de type T6SS avec la souche cible afin de quantifier l’effet de la mise à mort médiée par T6SS.
   REMARQUE: Les contrôles supplémentaires peuvent inclure une souche cible qui exprime le ou les gènes d’immunité nécessaires pour empêcher la mise à mort dépendante du T6SS ou une souche mutante inhibitrice exprimant des copies de type sauvage des gènes mutés chez les trans pour restaurer l’activité du T6SS¹.
3. Dans la mesure du possible, transformez des souches avec des plasmides stables codant pour des gènes pour différentes protéines fluorescentes (par exemple, GFP ou RFP) pour distinguer visuellement les types de souches au microscope. Ici, la souche inhibitrice est marquée avec un plasmide codé GFP (pVSV102), et la souche cible est marquée avec un plasmide à codage dsRed (pVSV208)²⁶.
   REMARQUE: S’il n’est pas possible d’utiliser des plasmides stables, des étiquettes fluorescentes peuvent être introduites sur le chromosome bactérien pour la visualisation^27,28.
4. Au cours de la période d’optimisation initiale, imagez des cultures clonales des souches marquées sous chacun des filtres fluorescents qui seront utilisés pendant l’expérience pour s’assurer que les cellules ne sont visibles que dans le canal prévu. Par exemple, assurez-vous qu’une souche marquée GFP n’est visible que dans le canal FITC.

2. Préparation du tampon d’agarose

1. Préparer la solution tampon d’agarose en dissolvant 2% d’agarose faiblement fondu (p / v) dans mPBS. Chauffer brièvement la solution au micro-ondes et dans le vortex jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute. Gardez cette solution au chaud en la plaçant dans un bain-marie à 55 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Voir la section Discussion pour plus d’informations sur la préparation des tampons d’agarose.
   REMARQUE: Ici, mPBS a été préparé en ajoutant 20 g / L de NaCl à la norme 1x PBS.
2. Enroulez cinq fois un morceau de ruban adhésif de laboratoire autour d’une lame de verre. Répétez ce processus une deuxième fois sur la même diapositive afin que la distance entre les deux morceaux de ruban adhésif soit légèrement inférieure à la largeur d’un couvercle(Figure 1A). Par exemple, si vous utilisez des couvercles^{de 25 mm 2,} les morceaux de ruban adhésif doivent être espacés d’environ 20 mm.
   REMARQUE: Bien que le nombre de fois que le ruban est enroulé autour de la glissière puisse être modifié pour ajuster l’épaisseur du tampon d’agarose, il est important que les couches de ruban adhésif soient de la même hauteur des deux côtés de la diapositive afin que le tampon d’agarose reste plat.
3. Pipette solution d’agarose chaude entre les deux morceaux de ruban adhésif et immédiatement recouvre d’un couvercle de sorte qu’il repose sur les morceaux de ruban adhésif. Cela garantira que la surface du tampon d’agarose reste plate. Le volume de solution d’agarose pipeté dans cette étape doit être suffisant pour que le couvercle entre en contact avec le liquide et pousse les bulles dans la solution d’agarose. Pour cette configuration particulière, 200 μL d’agarose chaude sont suffisants.
4. Laissez le tampon d’agarose se solidifier à température ambiante pendant au moins 1 h avant le test de co-co-lubrification. L’étape 2.2 produira un tampon d’agarose d’environ 20 mm².
5. Coupez ce tampon d’agarose avec une lame de rasoir en quatre tampons de 5 mm² à utiliser pour l’imagerie.
   REMARQUE: Les tampons d’agarose peuvent être fabriqués jusqu’à une semaine avant l’expérience et stockés à 4 ° C dans une plaque de Petri vide et stérile scellée avec un parafilm pour éviter le séchage.

3. Préparer les souches pour la co-incubation

1. Stroyez chaque souche à utiliser dans le test de co-lubrie à partir de -80 °C sur des plaques de gélose LBS complétées par les antibiotiques appropriés et incuber pendant la nuit à 24 °C. Pour cet exemple, trois souches sont utilisées : la souche inhibitrice de type sauvage, le mutant du système de sécrétion de type VI et la souche cible.
2. Le lendemain, commencez les cultures de nuit en double biologique en cueillant deux colonies de chaque souche et en les réutilisant dans un milieu LBS complété par les antibiotiques appropriés et en incubant pendant la nuit à 24 ° C en les agitant à 200 tr / min.
3. Le lendemain matin, chaque sous-culture biologique se réplique 1:1000 dans un milieu LBS frais sans antibiotiques et incube à 24 ° C en agitant pendant 4-5 h ou jusqu’à ce que les cellules atteignent un OD₆₀₀ d’environ 1,5.
   REMARQUE : Le calendrier des étapes 3.1, 3.2 et 3.3 peut devoir être optimisé pour différentes espèces bactériennes, car leur taux de croissance peut varier considérablement. Pour ce test, les cellules devaient être en phase mi-log au début du test de co-co-lubrie.

4. Souches bactériennes coincubate

1. En commençant par les cultures mi-logarithmiques de l’étape 3.3, mesurez et enregistrez la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀₎pour tous les échantillons.
2. Normaliser chaque échantillon à une OD₆₀₀ = 1,0, ce qui correspond à environ 10⁹ UFC/mL pour V. fischeri, en diluant la culture avec un milieu LBS.
3. Mélanger les deux souches concurrentes ensemble à un rapport de 1:1 basé sur le volume en ajoutant 30 μL de chaque souche normalisée à un tube marqué de 1,5 mL. Vortex la culture de souches mixtes pendant 1-2 s.
   NOTE: Dans certains cas, il peut être approprié de mélanger les cocultures dans différents ratios. Par exemple, lorsqu’une souche se développe beaucoup plus rapidement que l’autre, il peut être nécessaire de démarrer la souche à croissance plus lente avec un avantage numérique afin d’observer la concurrence. Une optimisation peut également être nécessaire si_{l’OD 600} ne correspond pas à une UFC/mL similaire pour les deux souches.
4. Répétez l’étape 4.3 pour chaque réplication biologique et chaque traitement. Dans l’exemple présenté ici, cela donnera un total de quatre tubes à souche mixte : deux répliques biologiques avec la souche inhibitrice de type sauvage mélangée à la souche cible et deux répliques biologiques avec la souche mutante du système de sécrétion de type VI mélangée à la souche cible.
5. Pour s’assurer que les cellules concurrentes sont suffisamment denses pour la mise à mort dépendante du contact dans la co-cubation sur le tampon de gélose, concentrez chaque culture mélangée 3 fois en centrifugant la culture mélangée dans un tube centrifuge standard de 1,5 mL pendant 1 min à 21 130 x g,en éliminant le surnageant et en resusmettant chaque pastille dans un milieu LBS de 20 μL. Répétez l’opération pour chaque échantillon.
   REMARQUE: Certaines cellules bactériennes sont sensibles aux dommages causés par la centrifugation à un rcf élevé; dans de tels cas, la culture mixte peut être centrifugée pendant 3 min à 4600 x g²⁹. De plus, lors de la quantification de la concurrence dépendante du contact, il est important de s’assurer d’une densité cellulaire suffisante sur la lame pour observer la mise à mort. Dans cet article, les traitements « surpeuplés », où l’on observe la mise à mort, avaient environ 10 cellules/20 μm²_; voir la section Discussion pour plus d’informations.

5. Configuration des diapositives

1. Lorsque vous utilisez un microscope vertical, placez un tampon d’agarose d’environ 5 mm² sur une lame de verre standard de 1 mm. Repérez 2 μL d’une culture mixte sur le tampon d’agarose et placez un couvercle #1.5 (25 mm²⁾sur le spot. Voir la figure 1B pour un exemple.
2. Lorsque vous utilisez un microscope inversé, repérez 2 μL d’une culture mixte sur le fond de couverture #1.5 d’une boîte de Petri de 35 mm et placez un tampon d’agarose d’environ 5 mm² sur le point de co-co-invention. Placez un couvercle en verre circulaire de 12 mm sur le tampon d’agarose. Voir la figure 1C pour un exemple.
3. Répétez l’étape 5.1 ou 5.2, selon la configuration du microscope utilisée, pour les trois cultures mixtes restantes, ce qui donne quatre lames ou paraboles à imager.
4. Laissez les toboggans reposer sur la paillasse pendant environ 5 minutes avant de passer à l’étape 6. Cela permet aux cellules de s’installer sur le coussinet de gélose et élimine les mouvements pendant le processus d’imagerie.

6. Microscopie à fluorescence

1. Commencez par vous concentrer sur les cellules en utilisant la lumière blanche (contraste de phase ou DIC) pour minimiser les effets du photo-blanchiment. En fonction de la taille moyenne d’une seule cellule bactérienne, utilisez un objectif d’huile 60x ou 100x.
2. Ajustez le temps d’exposition et les paramètres d’acquisition pour chaque canal afin que les cellules soient visibles dans le canal approprié avec une détection d’arrière-plan minimale.
   REMARQUE: Il est approprié d’utiliser des temps d’exposition différents pour différents canaux, mais le même temps d’exposition doit être utilisé dans tous les répliqués biologiques et les traitements pour un canal donné.
3. Pour chaque échantillon, sélectionnez au moins cinq champs de vision (FOV) et acquérez des images dans chaque canal approprié à l’aide des paramètres d’acquisition de l’étape 6.2 (voir les exemples de la figure 2). Enregistrez les points XY de chaque champ de vision afin que le même champ de vision puisse être imagé pendant le point temporel final. L’imagerie du même champ de vision à chaque point temporel est nécessaire pour déterminer la proportion de surface occupée par les cellules cibles ou inhibitrices au cours des étapes d’analyse.
   REMARQUE: Dans cet exemple, la fluorescence de GFP est détectée à l’aide d’un filtre avec une longueur d’onde d’excitation de 467 - 498 nm et un filtre d’émission de 513 - 556 nm et est faussement coloré en vert. La fluorescence de dsRed est détectée à l’aide d’un filtre avec une longueur d’onde d’excitation de 542 - 582 nm et un filtre d’émission de 603 - 678 nm et est magenta de fausse couleur.
4. Après 2 h, répétez l’étape 6.3 pour chaque échantillon en utilisant les points XY précédemment enregistrés (Fig 2).
   REMARQUE: Le moment des images ultérieures peut devoir être optimisé pour les organismes ayant des taux de croissance ou des mécanismes concurrentiels différents.

7. Analyse d’images aux FIDJI

1. Téléchargez et installez le logiciel de traitement d’image FIJI en utilisant les instructions disponibles ici: https://imagej.net/Fiji/Downloads
2. Ouvrez FIJI et importez des fichiers image pour analyse.
   REMARQUE: Dans la plupart des cas. Les fichiers TIFF seront utilisés pour l’analyse d’images, bien que certains logiciels d’acquisition d’images soient exportés à l’aide de types de fichiers propriétaires. FIJI peut reconnaître la plupart des types de fichiers propriétaires et les images peuvent être importées et analysées comme suit.
3. Pour chaque image acquise aux étapes 6.3 et 6.4, convertissez l’image en niveaux de gris, séparez les couches et commencez par seuilr (Ctrl + Maj + T) et créer un masque binaire de l’image prétraitée(Figure 3A,B).
   REMARQUE: Ici, les paramètres de seuil par défaut dans FIJI sont utilisés. Dans certains cas, il peut être nécessaire de modifier ces paramètres, auquel cas les mêmes paramètres doivent être utilisés pour toutes les images de cette expérience.
4. Définir l’échelle de l’image (Analyser | Définir l’échelle) en utilisant les valeurs appropriées pour la configuration de la microscopie²³.
5. Définir les mesures (Analyser | Définir Mesures) et sélectionnez Zone.
   REMARQUE: D’autres mesures peuvent être ajoutées si elles sont appropriées pour l’expérience. Seule la mesure de la surface de l’objet est requise pour l’exemple d’analyse présenté ici.
6. Analyser les particules (Analyser | Analyser les particules) à l’aide des paramètres par défaut (Figure 3C). S’il y a des débris dans l’échantillon, il peut être nécessaire d’ajuster la taille ou la circularité pour filtrer les particules non cellulaires. Sélectionnez Afficher | Contours de sorte que le résultat de cette analyse inclura un contour numéroté de toutes les particules analysées (Figure 3D).
   REMARQUE: La comparaison du contour de la figure 3D à l’image initiale est particulièrement importante dans l’étape d’optimisation pour s’assurer que (1) toutes les cellules sont analysées et (2) que tout débris est exclu de l’analyse.
7. Exportez les mesures de l’étape 7.4(Figure 3E)dans un tableur pour une analyse et un graphique plus approfondis.
8. Répétez les étapes 7.1 à 7.5 pour tous les canaux et images acquis au cours de l’expérience.

8. Calculer le pourcentage de la zone cible initiale au fil du temps

1. Pour chaque champ de vision analysé dans la section 7, assurez-vous que le fichier exporté contient une mesure de surface individuelle pour chaque particule analysée. En commençant par le canal de fluorescence de la souche cible, calculez la somme de la surface des particules pour chaque champ de vision individuel. Pour deux répliques biologiques avec cinq FOV chacune, cela devrait donner dix zones de somme par traitement à chaque point temporel.
2. Calculez le pourcentage de la zone cible initiale au fil du temps pour chaque champ de vision à l’aide de l’équation suivante : ( )
3. Répétez ce calcul pour tous les traitements et représentez graphiquement le pourcentage de la zone cible initiale (résultat de l’équation de l’étape 8.2) pour chaque traitement(figure 4A).
4. Déterminer s’il y a une augmentation nette de la population cible (indiquant la croissance), une diminution nette de la population cible (indiquant le décès) ou aucun changement (indiquant l’absence de croissance ou de décès) pour chaque traitement.
   REMARQUE : Le pourcentage de la zone cible initiale dont les valeurs sont supérieures à 100 indique une croissance cible nette, et les valeurs inférieures à 100 indiquent un décès net de la cible. Le pourcentage des valeurs cibles initiales qui restent à 100 n’indique aucun changement net dans la population cible. Voir la discussion pour des expériences de suivi suggérées.

9. Calculer le pourcentage de la surface initiale de l’inhibiteur au fil du temps

1. Répétez les étapes 8.1 à 8.3, cette fois en utilisant les mesures recueillies à partir du canal de fluorescence de la souche inhibitrice à la section 7(Figure 4B).
2. Déterminer s’il y a eu une augmentation nette de la population d’inhibiteurs (croissance); une diminution nette de la population d’inhibiteurs (décès), ou aucun changement pour chaque traitement. Les valeurs supérieures à 100 indiquent la croissance nette des inhibiteurs, et les valeurs inférieures à 100 indiquent la mort nette des inhibiteurs.

Résultats

Pour visualiser et quantifier les interactions concurrentielles entre les bactéries au niveau de la cellule unique, un protocole a été développé et optimisé pour V. fischeri en modifiant notre test bien établi basé sur l’UFC^1,2. Cette méthode utilise des plasmides stables codés GFP et dsRed pour distinguer visuellement différentes souches de V. fischeri. Le résultat concurrentiel de ces interactions peut être quantifié en analysant les images acquises à partir de ce test à l’aide du logiciel open source FIJI. À titre d’exemple, l’expérience suivante a été réalisée à l’aide d’isolats de V. fischeri. Une souche inhibitrice abritait un plasmide qui code GFP, et une souche cible abritait un plasmide qui code dsRed. Étant donné que le T6SS2 codé par l’inhibiteur est un mécanisme de destruction dépendant du contact, des traitements ont été inclus où les cellules étaient soit encombrées (contact cellule-cellule élevé), soit dispersées (contact cellule-cellule faible) sur une lame pour mettre en évidence l’impact de la configuration expérimentale sur les résultats finaux de ce test. Dans les données de l’échantillon, les souches concurrentes ont été mélangées à un rapport de 1:1 et incubées sur un tampon d’agarose pendant 2 h, et des images initiales et finales (2 h) ont été prises. Comme témoin, une souche mutante T6SS2 a également été co-traitée avec la souche cible dans des conditions de surpeuplé et dispersé. Les cultures de chaque souche ont été préparées et co-cocubatées comme décrit ci-dessus et des lames ont été préparées comme le montre la figure 1.

La figure 2 montre des images de microscopie à fluorescence représentatives de chaque traitement expérimental avec le même champ de vision imagé à un point temporel initial et final. Pour chaque traitement, un inhibiteur de type sauvage ou une souche mutante T6SS hébergeant un plasmide codé GFP a été mélangé à un rapport de 1:1 avec la souche cible hébergeant un plasmide codé dsRed. Au cours d’une période de co-cubation de 2 h avec cette configuration expérimentale, les cellules de V. fischeri en croissance peuvent passer par 1-2 divisions (Figure 2; flèches grises). Dans la figure 2A,le contact cellule-cellule a été forcé entre la cible et l’inhibiteur en concentrant la culture mélangée avant de la repérer sur la lame. On observe que plusieurs cellules cibles deviennent arrondies et/ou disparaissent au cours de 2 h, ce qui correspond à l’élimination des cellules cibles par l’inhibiteur (Figure 2; flèches blanches). Consultez la section Discussion pour plus d’informations sur l’interprétation des cellules cibles arrondies ou lysées. Dans la figure 2B,la même co-cubation a été repérée sur une lame, cette fois sans concentrer la culture mixte, de sorte que les cellules sont restées dispersées et qu’il y ait un contact minimal entre les souches sur la lame. Ici, aucune cellule cible n’est observée pour disparaître ou arrondir, ce qui suggère que la souche cible n’a pas été inhibée dans ce traitement. La figure 2C et la figure 2D montrent les mêmes traitements surpeuplés et dispersés décrits ci-dessus, cette fois en utilisant un mutant T6SS comme souche inhibitrice. On n’a pas observé que les cellules cibles disparaissaient ou tournaient lorsqu’elles étaient co-co-traitées avec un mutant T6SS dans des conditions surpeuplées ou dispersées, ce qui suggère à nouveau que la cible n’était pas inhibée dans l’un ou l’autre traitement.

La figure 3 montre le flux de travail d’analyse FIJI utilisé pour quantifier la concurrence dans ce protocole. Une image représentative de la couche cible a été sélectionnée (Figure 3A) et un masque binaire a été créé à l’aide des paramètres de seuil par défaut dans FIJI (Figure 3B). L’échelle de l’image a été réglée de manière appropriée pour cette configuration de microscopie. Les particules ont été analysées en utilisant le paramètre de taille = 0 - infini, le paramètre de circularité = 0,00 - 1,00, et Show Outlines a été sélectionné (Figure 3C). Les résultats de cette analyse de particules sont présentés à la fois sous la forme d’un contour numéroté de chaque particule(Figure 3D)et d’un tableau avec des colonnes pour le numéro de particule, le nom du fichier (étiquette) et la zone de particule en^{μm 2} (zone) (Figure 3E).

Dans la figure 4,les données obtenues à partir de la figure 3E sont représentées graphiquement et analysées. Dans la figure 4A, le pourcentage de la zone cible initiale au point temporel final est présenté pour chaque traitement conformément à l’étape 8.2. Si le pourcentage de la zone cible initiale est supérieur à 100, cela représente une augmentation nette de la cible (c.-à-d. la croissance) et est observé dans des conditions où la population cible n’est pas inhibée de manière significative. Toutefois, si le pourcentage de la zone cible initiale est inférieur à 100, ce résultat indique une diminution nette de la cible (c.-à-d. décès) et est observé dans des conditions où la population cible est considérablement inhibée. Lorsque la cible a été co-frappée avec un inhibiteur de type sauvage dans des conditions de surpeuplé, les données montrent une diminution nette de la zone cible. En revanche, lorsque la cible a été co-frappée avec un inhibiteur de type sauvage dans des conditions dispersées ou un mutant T6SS dans des conditions surpeuplées ou dispersées, les données montrent une augmentation nette de la zone cible. Le pourcentage de la zone cible initiale lorsque la cible a été co-traitée avec un inhibiteur de type sauvage dans des conditions de surpeuplé était inférieur à 100 et significativement inférieur à tous les autres traitements selon une ANOVA unidirectionnelle suivie d’un test de comparaisons multiples de Tukey pour tous les traitements(p < 0,0001). Ces données indiquent que la mort cellulaire cible dépend d’un T6SS fonctionnel dans l’inhibiteur et soulignent l’importance d’une configuration expérimentale qui permet un contact cellule-cellule suffisant, afin de détecter la mort cellulaire d’un mécanisme de destruction dépendant du contact.

La figure 4B présente le pourcentage de la surface initiale de l’inhibiteur au point temporel final pour chaque traitement. Dans cet exemple, une croissance nette de la souche inhibitrice a été observée dans tous les traitements. Cependant, le pourcentage de la surface initiale des inhibiteurs était significativement plus élevé lorsqu’un inhibiteur de type sauvage était coïncidé avec la cible dans des conditions de surpeuplé par rapport à tous les autres traitements selon une ANOVA unidirectionnelle suivie d’un test de comparaisons multiples de Tukey sur tous les traitements(p < 0,0001). Initialement, nous avons considéré que l’augmentation nette de la surface inhibitrice peut être entraînée par l’augmentation de l’espace disponible pour se développer à mesure que les cellules cibles sont éliminées. Cependant, cette même augmentation de la croissance des inhibiteurs n’a pas été observée dans les traitements dispersés, où les cellules inhibitrices avaient de la place pour se développer dès le début de la co-co-lubrisation. Alternativement, ce résultat pourrait suggérer que les nutriments libérés par les cellules cibles de lysage permettent une plus grande augmentation de la population d’inhibiteurs. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la souche inhibitrice élimine la cible d’une manière dépendante de T6SS uniquement lorsque le contact cellulaire élevé est forcé par l’encombrement des cellules sur la lame.

Figure 1: Préparation des tampons d’agarose et configuration des lames pour les essais de co-cubation. (A) Configuration pour la fabrication de tampons d’agarose à 2%. Cinq couches de ruban adhésif de laboratoire (vert) sont enroulées autour d’un couvercle à deux endroits espacés d’environ 20 mm. Ensuite, l’agarose chaude à 2% en mPBS (jaune) est pipetée entre les morceaux de ruban adhésif et immédiatement recouverte d’un couvercle^{de 25} mm 2 et laissée se solidifier pendant au moins 1 h à température ambiante. Utilisez une lame de rasoir pour couper le tampon d’agarose en ~ 5 mm² pièces et utilisez une pince à épiler pour transférer le tampon sur une nouvelle lame pour l’imagerie. (B) Lors de l’imagerie sur un microscope vertical, placez le tampon d’agarose^{de 5} mm 2 directement sur la lame, en suivant la culture mixte (bleu) et un couvercle circulaire #1.5 de 12 mm. (C) Lors de l’imagerie sur un microscope inversé, repérez la culture mélangée directement sur le fond de glissement du couvercle en verre #1.5 d’une boîte de Petri de 35 mm et placez un tampon d’agarose sur le dessus de la culture suivi d’un deuxième glissement de couvercle circulaire de 12 mm pour aplatir le tampon d’agarose. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Images en accéléré de points de co-co-lubration dans des conditions surpeuplées ou dispersées. (A) Images représentatives aux points temporels initiaux et finaux où une culture mixte d’inhibiteur cible et d’inhibiteur de type sauvage était concentrée 3 fois avant d’être repérée sur la lame pour forcer le contact cellule-cellule entre les souches. Les flèches blanches dans le canal TRITC indiquent des exemples de cellules cibles qui s’arrondissent ou se lysent tout au long de l’expérience. (B) Images représentatives où une culture mixte d’inhibiteur cible et d’inhibiteur de type sauvage a été repérée sans concentration, de sorte que les cellules sont dispersées et qu’il y a un contact cellule-cellule minimal entre les souches. Des flèches grises dans les canaux FITC et TRITC indiquent des exemples de division cellulaire tout au long de l’expérience. (C) Images représentatives où la culture mixte de la cible et du^mutant T6SS a été concentrée 3 fois avant d’être repérée sur la lame pour forcer le contact cellule-cellule entre les souches. (D) Images représentatives où une culture mixte de cible et de^mutant T6SS a été repérée sans concentration, de sorte que les cellules sont dispersées et qu’il y a un contact cellule-cellule minimal entre les souches. Barres d’échelle = 5 μm et sont cohérentes sur toutes les images; Le canal TRITC est de fausse couleur magenta, le canal FITC est de fausse couleur verte. La déconvolution a été effectuée sur toutes les images; l’arrière-plan a été soustrait et la luminosité/contraste ajusté uniformément sur toutes les images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Flux de travail d’analyse FIJI. (A) Image représentative pour l’analyse. Ce flux de travail est répété pour les deux canaux dans tous les champs de vue et échantillons. Barres d’échelle = 5 μm et sont cohérentes sur toutes les images; Le canal TRITC est de fausse couleur magenta, le canal FITC est de fausse couleur verte. (B) Masque binaire créé en seuilnant l’image à l’aide des paramètres par défaut de FIJI. (C) Exemple de paramètres pour l’analyse des particules utilisés dans ce manuscrit. Plage de taille = 0 - infini μm²; circularité = 0,00 - 1,00; show = contours. (D) Contour des particules créé en tant que résultat de l’analyse des particules en (C). Le contour des particules en (D) doit être comparé à l’image originale (A) pour s’assurer que toutes les cellules ont été capturées lors de l’analyse des particules. (E) Tableau des résultats créé à partir d’une sortie de l’analyse des particules dans (C). Le numéro d’objet (colonne 1) correspond à des particules individuelles (une ou plusieurs cellules) soulignées et étiquetées en rouge dans le panneau (D). Label = nom de fichier de l’image analysée; Surface = surface totale des particules en μm². Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Données d’échantillonnage pour évaluer si la souche cible est inhibée. Pourcentage de la surface initiale aux points temporels finaux pour la souche cible(A)et la souche inhibitrice(B),à différentes densités cellulaires initiales. La densité de glissement indique soit une densité cellulaire de départ qui est encombrée (contact cellulaire élevé entre les souches), soit plus dispersée (faible contact cellulaire entre les souches) comme décrit à la figure 2. Le génotype inhibiteur indique qu’une souche de type sauvage ou mutantE T6SS (T6SS^-) a été coïncidée avec la souche cible. Les astérisques indiquent une différence significative dans la variation en % par rapport à tous les traitements (ANOVA unidirectionnelle suivie d’un test de comparaisons multiples de Tukey comparant tous les traitements; (p < 0,0001). La ligne pointillée n’indique aucun changement net dans la zone de déformation entre le point temporel initial et final; une variation en % > 100 indique une augmentation nette (c.-à-d. une croissance) et une variation < 100 en % indique une diminution nette (c.-à-d. la mort cellulaire). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit ci-dessus fournit un outil puissant pour quantifier et caractériser la compétition interbactérielle au niveau de la cellule unique. Ce test, qui a été développé en modifiant notre test de compétition basé sur l’UFC sur des plaques de gélose^1,2, a permis de visualiser la concurrence unicellulaire entre les isolats de V. fischeri et des suggestions sont fournies pour optimiser la méthode pour un large éventail de systèmes et de configurations de microscopie. Bien que la méthode décrite ici ait été optimisée pour le symbiote d’organes légers V. fischeri,elle peut être facilement modifiée pour accueillir de nombreux microbes divers et cultivables. Il est important de noter que les mécanismes de concurrence peuvent être régulés par n’importe quel nombre de variables environnementales, y compris la température, la salinité et la viscosité^30,31^,32,33,34. Des travaux antérieurs ont confirmé que V. fischeri est en compétition à l’aide d’un système de sécrétion de type VI dépendant du contact qui est actif sur les surfaces^30,ce qui rend les conditions décrites dans ce test adaptées à l’étude de la concurrence entre les souches exemples. Il est également important de tenir compte de la densité initiale des cellules sur la lame lors de la quantification de la compétition bactérienne. Étant donné que le contact entre les cellules cibles et inhibitrices est souvent nécessaire pour que la mise à mort se produise, la culture mixte doit être concentrée de manière à maximiser le contact cellule-cellule et que les cellules restent dans un seul plan sur la lame. Les cultures cellulaires doivent être cultivées à une densité optique similaire (phase mi-logarithmique), puis concentrées pour forcer le contact plutôt que de simplement cultiver des cultures à une densité optique plus élevée en raison des changements physiologiques des cellules dans différentes phases de croissance. Dans d’autres systèmes, les conditions de culture et la configuration expérimentale peuvent devoir être modifiées pour s’assurer que le mécanisme concurrentiel est actif et peut être détecté dans la condition de co-cocuation.

Les tampons d’agarose utilisés dans ce test offrent plusieurs avantages: ils assurent une stabilisation afin que les cellules ne se déplacent pas librement et empêchent la culture de se dessécher au cours de l’expérience. De plus, si des inducteurs chimiques, tels que l’isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), sont nécessaires pour l’expérience, ils peuvent facilement être ajoutés à la solution d’agarose. Cependant, il est important de noter que la préparation d’agarose devra probablement être ajustée pour différents systèmes. Dans l’exemple décrit ci-dessus, le tampon d’agarose a été préparé en dissolvant 2% d’agarose (p/v) en mPBS à 20 psu, qui est la salinité standard utilisée dans le milieu de croissance de V. fischeri. En outre, dans certains cas, une source de carbone peut devoir être ajoutée au tampon d’agarose pour que les cellules se développent et rivalisent au cours d’expériences plus longues. Dans un tel cas, le mPBS dans les tampons d’agarose peut être remplacé par n’importe quel milieu de croissance, bien que les nutriments dans le milieu de croissance puissent venir avec le compromis d’une fluorescence de fond supplémentaire.

Sans logiciel d’analyse d’image propriétaire, il peut être très difficile d’obtenir un nombre de cellules individuelles lorsque le contact cellule-cellule est élevé, ce qui, comme nous le montrons ici, est nécessaire pour observer la destruction dépendante du contact. Ce test a été conçu pour fournir une méthode alternative de quantification qui ne repose pas sur le nombre de cellules individuelles. Au lieu de cela, la surface cellulaire totale pour chaque canal de fluorescence est utilisée pour quantifier l’étendue de la destruction entre les souches co-co-frappées. Étant donné que cette méthode repose sur la zone plutôt que sur le nombre de cellules individuelles, les paramètres de seuil par défaut sont généralement suffisants pour définir la surface totale des cellules. La précision du seuil peut être vérifiée en divisant la surface totale de l’objet pour un champ de vision représentatif par la taille moyenne des cellules de l’organisme modèle et en comparant ce nombre de cellules estimé à un nombre manuel de cellules pour la même image.

Dans les co-substances entre un inhibiteur et une souche cible (non tueuse), la croissance nette de l’inhibiteur est prédite. Comme le montre la figure 4, lacroissance des inhibiteurs peut être significativement plus élevée dans les traitements où la mise à mort est observée, par rapport aux traitements où la destruction n’est pas observée, peut-être parce que les nutriments libérés par la lyse des cellules cibles permettent à la souche inhibitrice de se développer plus rapidement. Dans l’exemple présenté ici, la mort nette de la cible est observée parce que la compétition médiée par le T6SS entraîne une lyse de la cellule cible où la cible est physiquement éliminée. Cependant, il est important de noter que tous les mécanismes concurrentiels n’entraînent pas l’élimination physique des cellules cibles. Si une cible est neutralisées par une toxine qui provoque une inhibition de la croissance, le protocole décrit ici peut faire en sorte que la population cible visible reste stable au fil du temps, car les cellules cibles ne se développent plus, mais ne se lysent pas. Dans un tel cas, il serait approprié de comparer les résultats de ce test avec des tests de suivi pour la viabilité des cellules cibles, tels que le placage pour les unités formant des colonies (UCU) ou en effectuant des essais sur des morts vivants par coloration avec de l’iodure de propidium ou du vert SYTOX^35,36.

Comparé aux essais de co-cubation qui reposent sur le nombre d’UFC, ce test permet d’observer et de quantifier la structure spatiale de la compétition entre les souches et de suivre les changements dans la morphologie des cellules cibles au fil du temps. Par exemple, les cellules inhibitrices qui tuent à l’aide d’un T6SS sont connues pour coder des protéines du domaine LysM qui dégradent la paroi cellulaire cible, entraînant un arrondi initial des cellules, puis une lyse¹³, que nous avons observée dans l’exemple illustré à la figure 2A. En outre, ce protocole peut être utilisé pour suivre la concurrence à haute résolution sur des échelles de temps très courtes. Dans l’exemple présenté ici, une diminution significative de la zone cible est observée après seulement deux heures lorsque les cellules sont encombrées et que le contact cellule-cellule est forcé entre les souches (Figure 4). L’analyse d’image décrite ici pourrait également être réalisée par microscopie confocale, ce qui permettrait d’étudier la compétition bactérienne in vivo ou dans des biofilms complexes, sans perturber la distribution spatiale des souches co-co-filmées.

En résumé, le test décrit ici vise à fournir une approche accessible et facilement modifiée pour visualiser et quantifier la concurrence bactérienne au niveau de la cellule unique en utilisant la microscopie à fluorescence. Cette méthode peut être appliquée à divers isolats bactériens et peut être utilisée pour visualiser la compétition bactérienne même dans des environnements complexes tels que dans une matrice d’hôte ou de biofilm.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher	05-408-129
10 uL single channel pipette
1000 uL single channel pipette
20 uL single channel pipette
200 uL single channel pipette
Agarose	Fisher	BP165-25	Low melting agarose
Calculator
Cellvis 35 mm Dish	Fisher	NC0409658	#1.5 cover glass bottom
Chloramphenicol	Sigma	C0378	stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS)
DAPI Nucleic Acid Stain	Fisher	EN62248	optional (if not using stable plasmids)
FIJI image analysis sofware	ImageJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	open-source software
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	Fisher	12-545-81P	#1.5 cover glass; 12 mm diameter
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Lens Cleaning Tissue Paper	Fisher	S24530
Parafilm	Fisher	13-374-12
Petri Plates	Fisher	FB0875713	sterile with lid
Razor Blades	Fisher	S65921
Semi-micro Cuvettes	VWR	97000-586
Spectrophotometer
SYBR Green Nucleic Acid Stain	Fisher	S7563	optional (if not using stable plasmids)
Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides	Fisher	12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass	Fisher	22-050-235	#1.5 cover glass, 25 mm2
Type F Immersion Oil	Fisher	NC0297589
Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software			Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software.
Vortex
Water bath			Used to keep agarose warm prior to pipetting
LBS media
1M Tris Buffer (pH ~7.5)			50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (Add only for plates)
DI water			950 mL
Sodium Chloride	Fisher	S640-3	20 g
Tryptone	Fisher	BP97265	10 g
Yeast Extract	Fisher	BP9727-2	5 g
mPBS (marine PBS)			Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad
10X PBS	Fisher	ICN1960454
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS1-160P	Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here
Sterile Vacuum Filter Units	Fisher	SCGVU01RE	Used to filter-sterilize mPBS
Vacuum pump			Used to filter-sterilize mPBS