Traitement des échantillons protéomiques Shotgun automatisé par un robot de laboratoire open source

Résumé

Un protocole détaillé et trois scripts Python sont fournis pour l’exploitation d’un système de manipulation robotique de liquides open source permettant d’effectuer une préparation semi-automatisée d’échantillons de protéines pour des expériences de spectrométrie de masse, couvrant l’élimination des détergents, la digestion des protéines et les étapes de dessalement des peptides.

Résumé

Les expériences de protéomique au fusil de chasse basées sur la spectrométrie de masse nécessitent plusieurs étapes de préparation des échantillons, y compris la digestion et le nettoyage des protéines enzymatiques, ce qui peut prendre des heures importantes de travail de laboratoire et présenter une source de variabilité de lot à lot. L’automatisation des laboratoires avec des robots de pipetage peut réduire le travail manuel, maximiser le débit et augmenter la reproductibilité de la recherche. Pourtant, les prix de départ élevés des stations d’automatisation standard les rendent inabordables pour de nombreux laboratoires universitaires. Cet article décrit un flux de travail de préparation d’échantillons protéomiques à l’aide d’un système d’automatisation open source abordable (The Opentrons OT-2), y compris des instructions pour mettre en place des étapes semi-automatisées de réduction des protéines, d’alkylation, de digestion et de nettoyage; ainsi que des scripts Python open source pour programmer le système OT-2 via son interface de programmation d’applications.

Introduction

La protéomique au fusil de chasse basée sur la spectrométrie de masse est un outil puissant pour mesurer simultanément l’abondance de nombreuses protéines dans des échantillons biologiques. Les expériences protéomiques avec l’analyse bioinformatique sont couramment utilisées pour identifier les biomarqueurs et découvrir les complexes biologiques associés et les voies qui sous-tendent les mécanismes pathologiques. Avec sa grande spécificité d’analyte et sa précision quantitative potentielle, la protéomique des fusils de chasse a également un excellent potentiel pour être adoptée par les installations de recherche et les laboratoires de diagnostic pour l’analyse d’échan....

Protocole

Les scripts Python développés ont été déposés sur GitHub à l’adresse : https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Une copie des scripts est remise dans le dossier supplémentaire 1. Veuillez vous référer au référentiel GitHub pour les dernières versions.

1. Préparations expérimentales

1. Vérifiez le matériel requis avant de démarrer le protocole.
   REMARQUE: Les composants matériels suivants sont requis: pipettes OT-2, embouts de pipette, ensemble de racks de tubes 4-en-1, ensemble de blocs en aluminium, module magnétique, module de température, plaques de puits de 96 puits de 2 mL....

Résultats

Trois scripts Python sont fournis ici qui sont compatibles avec le robot OT-2, et qui effectuent la préparation d’échantillons pour la protéomique de spectrométrie de masse avec une seule protéine albumine sérique bovine standard (répliques techniques n = 5 digestions) et un échantillon de lysat cardiaque humain contenant un détergent (n = 5 digestions). Chaque produit de digestion est divisé en deux réactions de nettoyage peptidique. Le nombre de correspondances peptide-spectre (MSP), de peptides et de prot.......

Discussion

Étapes critiques du protocole
Pour de meilleures performances, des logiciels de laboratoire, des modules et des consommables compatibles avec OT-2 vérifiés par Opentrons doivent être utilisés. Des logiciels de laboratoire personnalisés peuvent être créés en suivant les instructions d’Opentrons à la référence ¹⁴. Assurez-vous de calibrer le pont OT-2, les pipettes et le matériel de laboratoire lorsqu’ils sont utilisés pour la première fois. Il est également e.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 µL pipette tips	Opentrons
4-in-1 tube rack set	Opentrons		Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column	Thermo Scientific	#164568	3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm
Acetonitrile LC-MS grade	VWR	#JT9829
Aluminum block set	Opentrons		This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.
Ammonium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	# A6141
Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL	Thermo Scientific	#23210
Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade	Thermo Scientific	#85190
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	#D5545
EASY-Spray HPLC Columns	Thermo Scientific	#ES800A
EasynLC 1200 Nano LC	Thermo Scientific	#LC140
Ethanol Proof 195-200	Fisher	#04-355-720
Formic Acid LC-MS grade	Thermo Scientific	#85178
Human heart lysate	Novus Biologicals	NB820-59217
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	#I1149
Magnetic tube rack	Thermo Scientific	#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43			Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini Centrifuge	Thermo Scientific	#75004061	benchtop mini centrifuge for quick spin
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom	Opentrons
OT-2 magnetic module	Opentrons		GEN1
OT-2 P300 single channel pipette	Opentrons		GEN1
OT-2 P50 single channel pipette	Opentrons		GEN1
OT-2 robot pipetting robot	Opentrons	OT-2
OT-2 temperature module	Opentrons		GEN1
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Scientific	#23275
Protein LoBind tubes 2.0 mL	Eppendorf	#022431102
Protein Sequence Database	UniProt/SwissProt		https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic	Cytiva	#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic	Cytiva	#45152105050250
SpeedVac	Thermo Scientific		Vacuum evaporator
Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer	Thermo Scientific	#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsin MS Grade	Thermo Scientific	#90057
Water LC-MS grade	VWR	#BDH83645.400