L’application d’approches basées sur la recherche ouverte pour l’identification des glycopeptides liés à L’O d’Acinetobacter baumannii

Résumé

La recherche ouverte permet d’identifier des glycopeptides décorés avec des compositions de glycanes jusque-là inconnues. Dans cet article, une approche simplifiée pour entreprendre une recherche ouverte et des recherches ultérieures de glycopeptides axées sur le glycane est présentée pour des échantillons bactériens en utilisant Acinetobacter baumannii comme modèle.

Résumé

La glycosylation des protéines est de plus en plus reconnue comme une modification courante au sein des organismes bactériens, contribuant à la physiologie procaryote et à l’infectiosité optimale des espèces pathogènes. Pour cette raison, il existe un intérêt croissant pour la caractérisation de la glycosylation bactérienne et un besoin d’outils analytiques à haut débit pour identifier ces événements. Bien que la protéomique ascendante permette facilement la génération de riches données sur les glycopeptides, l’étendue et la diversité des glycanes observés chez les espèces procaryotes rendent l’identification des événements de glycosylation bactérienne extrêmement difficile.

Traditionnellement, la détermination manuelle des compositions de glycanes dans les ensembles de données protéomiques bactériennes en faisait une analyse largement sur mesure réservée aux experts spécifiques au domaine. Récemment, les approches ouvertes basées sur la recherche sont apparues comme une alternative puissante pour l’identification de modifications inconnues. En analysant la fréquence des modifications uniques observées sur les séquences peptidiques, les techniques de recherche ouverte permettent d’identifier les glycanes communs attachés aux peptides dans des échantillons complexes. Cet article présente un flux de travail rationalisé pour l’interprétation et l’analyse des données glycoprotéomiques, démontrant comment des techniques de recherche ouvertes peuvent être utilisées pour identifier les glycopeptides bactériens sans connaissance préalable des compositions de glycanes.

En utilisant cette approche, les glycopeptides dans les échantillons peuvent rapidement être identifiés pour comprendre les différences de glycosylation. En utilisant Acinetobacter baumannii comme modèle, ces approches permettent de comparer les compositions de glycanes entre les souches et d’identifier de nouvelles glycoprotéines. Pris ensemble, ces travaux démontrent la polyvalence des techniques de recherche dans des bases de données ouvertes pour l’identification de la glycosylation bactérienne, ce qui rend la caractérisation de ces glycoprotéomes très divers plus facile que jamais.

Introduction

La glycosylation des protéines, le processus de fixation des glucides aux molécules de protéines, est l’une des modifications post-traductionnelles (PTM) les plus courantes dans la nature ^1,2. Dans tous les domaines de la vie, une gamme de machines complexes a évolué dédiée à la génération de glycoprotéines qui ont un impact sur une myriade de fonctions cellulaires 1,3,4,5. Alors que la glycosylation des protéines se produit sur une gamme d’acides aminés

Protocole

REMARQUE: La préparation et l’analyse des échantillons de glycopeptides bactériens peuvent être divisées en quatre sections (Figure 1). Pour cette étude, la glycosylation de trois souches séquencées d’A. baumannii a été évaluée (tableau 1). Les bases de données Proteome FASTA de chacune de ces souches sont accessibles via Uniprot. Reportez-vous au tableau 2 pour connaître la composition des tampons utilisés dans ce protocole.

1. Préparation d’échantillons de protéines pour l’analyse protéomique

1. Isolement d’échantillons de protéome d’intérêt

Résultats

Pour illustrer l’utilité de la recherche ouverte pour l’analyse des glycopeptides bactériens, la diversité chimique des glycanes liés à l’O dans trois souches d’A. baumannii-AB307-0294, ACICU et D1279779- a été évaluée. Les glycoprotéomes liés à l’O sont très variables entre les souches d’A. baumannii car les glycanes utilisés pour la glycosylation sont dérivés des loci 44,45,46 de la capsule très variable.

Discussion

La recherche ouverte est une méthode efficace et systématique pour identifier les modifications inconnues. Alors que l’identification de glycanes inconnus dans des échantillons de protéome bactérien a toujours été une entreprise longue et techniquement spécialisée, les récents développements d’outils tels que MSfragger^21,41 et Byonic^31,38 permettent maintenant l’identification rapide et e.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 G Kel-F Hub point style 3	Hamilton company	hanc90514
2-Chloroacetamide	Sigma Aldrich Pty Ltd	C0267-100G
Acetonitrile	Sigma Aldrich Pty Ltd	34851-4L
Ammonium hydroxide (28%)	Sigma Aldrich Pty Ltd	338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent A	Pierce	23228
BCA Protein Assay Reagent B	Pierce	23224
C8 Empore SPE	Sigma Aldrich Pty Ltd	66882-U	An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acid	Sigma Aldrich Pty Ltd	5.33002
Isopropanol	Sigma Aldrich Pty Ltd	650447-2.5L
Methanol	Fisher Chemical	M/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate)	Sigma Aldrich Pty Ltd	66886-U	An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium Deoxycholate	Sigma Aldrich Pty Ltd	D6750-100G
ThermoMixer C	Eppendorf	2232000083
trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Pty Ltd	302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride	Sigma Aldrich Pty Ltd	C4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma Aldrich Pty Ltd	252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixture	Promega	V5073
Vacuum concentrator	Labconco	7810040
ZIC-HILIC material	Merck	1504580001	Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin