Transformation naturelle, expression des protéines et cryoconservation de la cyanobactérie filamenteuse Phormidium lacune

Résumé

La lacune de Phormidium est une cyanobactérie filamenteuse qui a été isolée à partir de bassins rocheux marins. Cet article décrit l’isolement des filaments à partir de sources naturelles, l’extraction de l’ADN, le séquençage du génome, la transformation naturelle, l’expression du sfGFP, la cryoconservation et les méthodes de motilité.

Résumé

Les cyanobactéries font l’objet de recherches fondamentales et de projets biotechnologiques dans lesquels l’énergie solaire est utilisée pour la production de biomasse. La lacune de Phormidium est une cyanobactérie filamenteuse nouvellement isolée. Cet article décrit comment de nouvelles cyanobactéries filamenteuses peuvent être isolées à partir de bassins rocheux marins. Il décrit également comment l’ADN peut être extrait des filaments et comment les génomes peuvent être séquencés. Bien que la transformation soit établie pour de nombreuses espèces unicellulaires, elle est moins fréquemment rapportée pour les cyanobactéries filamenteuses. Une méthode simplifiée pour la transformation naturelle de P. lacuna est décrite ici. P. lacuna est le seul membre de l’ordre des Oscillatoriales pour lequel une transformation naturelle est établie. Cet article montre également comment la transformation naturelle est utilisée pour exprimer la protéine fluorescente verte superdosseuse (sfGFP). Un promoteur cpcB endogène a induit une expression environ 5 fois plus forte que les promoteurs cpc560, A2813 ou psbA2 de Synechocystis sp. PCC6803. En outre, une méthode de cryoconservation de P. lacuna et de Synechocystis sp.CPP 6803 a été établie, et des méthodes d’évaluation de la motilité dans un milieu liquide et sur des surfaces en gélose et en plastique sont décrites.

Introduction

Les cyanobactéries sont des organismes procaryotes qui utilisent la photosynthèse comme source d’énergie ^1,2. La recherche se concentre de plus en plus sur les espèces cyanobactériennes. Plusieurs cyanobactéries peuvent être transformées avec de l’ADN³. Les gènes peuvent être assommés ou surexprimés chez ces espèces. Cependant, la transformation est limitée à quelques espèces 4,5,6,7,8,9,10,11, et il peut être difficile d’établir une transformation dans les souches des collections de culture ou de la nature 8.^<....

Protocole

1. Isolement de l’environnement naturel

REMARQUE: Les algues vertes, les diatomées, les cyanobactéries filamenteuses et d’autres microalgues peuvent être isolées. Le protocole peut être utilisé pour toutes les espèces de microalgues provenant de bassins rocheux poussant dans des conditions de laboratoire. Les cyanobactéries filamenteuses qui appartiennent aux oscillatoriales peuvent être facilement reconnues par leur mouvement et leur forme filamenteuse. L’espèce peut être identifiée dans un état semi-pur par séquençage du génome ou séquençage de l’ARNr 16S.

1. Transférer des échantillons d’eau de mer liquide provena....

Résultats

Selon les méthodes susmentionnées, 5 souches différentes de P. lacuna ont été isolées dans des bassins rocheux et séquencées (figure 1 et tableau 1). Toutes les cultures étaient stériles après environ 1 an de sous-culture, à l’exception de P. lacuna HE10JO. Cette souche est toujours contaminée par Marivirga atlantica, une bactérie marine. Au cours des excursions ultérieures à Helgoland, d’autres cyanobactéries filamenteuses ont.......

Discussion

Bien que de nombreuses souches de cyanobactéries soient disponibles dans les collections de culture ^{32,33,34,35,36}, il existe toujours une demande de nouvelles cyanobactéries de la nature car ces espèces sont adaptées à des propriétés spécifiques. P. lacuna a été prélevé dans des bassins rocheux et est adapté aux variations des concentrat.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave 3870 ELV	Tuttnauer	3870 ELV
Bacto Agar	OttoNorwald	214010
BG-11 Freshwater Solution	Sigma Aldrich	C3061
BG-11 medium	Merck	73816-250ML
Boric acid	Merck	10043-35-3	H3BO3
Calcium chloride dihydrate	Carl Roth	10035-04-8	CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL	Greiner	658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL	Greiner	601975
Centrifuge LYNX 4000	Thermo Scientific	75006580	and rotor
Centrifuge microstar 17	VWR International	N/A	for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)	PanReac AppliChem	57-09-0	C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1	PanReac AppliChem	A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate	Merck	7791-13-1	CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate	Merck	7758-99-8	CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin	Carl Roth	58-85-5	C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb	New England Biolabs	N3232
DNA ladder 100 bp	New England Biolabs	N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S	Brand GmbH	26360	for pipetting 1-25 mL
Ethanol	VWR	64-17-5	C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate	Carl Roth	6381-92-6	EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome	Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2	Zeiss
French Pressure Cell Press	American Instrument Company	N/A
Gel documation System Saffe Image	Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu	ADVANCED
Glassware, different
Glycerol	Carl Roth	56-81-5	C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate	Merck	10025-77-1	FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin	Sigma-Aldrich	25389-94-0
Kanamycin sulphate	Carl Roth	25389-94-0	C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)	Sigma Aldrich	137-16-6	C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox)	Carl Roth	X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight	OSRAM		cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W	Bloom Star	N/A	cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	7791-18-6	MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Serva	13446-34-9	MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750	Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +	Conrad Electronics	2138863-YD	for time-lapse recording
Ocular camera EC3	Leica		for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD	Bresser		for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm	Merck	P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000	Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS	Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL	Gilson	SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL	Gilson	SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile	Greiner	607107
Plastic tube, sterile, 15 mL	Greiner	188271
Plastic tube, sterile, 50 mL	Greiner	227261
Potassium bromide	Carl Roth	7758-02-3	KBr
Potassium chloride	Carl Roth	7447-40-7	KCl
Power supply Statron 3252-1	Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005	Conrad Electronics		for LED
Proteinase K	Promega	MC500C	from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase	New England Biolabs	M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5	Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002	Illumina
Shaker Unimax 2010	Heidolph Instruments		for cultivation
Sodium acetate	Carl Roth	127-09-3	NaCH3COO
Sodium chloride	Carl Roth	7647-14-5	NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Carl Roth	10049-21-5	NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride	Carl Roth	7681-49-4	NaF
Sodium hydrogen carbonate	Carl Roth	144-55-8	NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate	Serva	10102-40-6	Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate	Merck	7631-99-4	NaNO3
Sodium sulphate	Carl Roth	7757-82-6	Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate	Carl Roth	10025-70-4	SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride	Merck	67-03-8	C12H17ClN4OS · HCl
TRIS	Carl Roth	77-86-1	C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3	Hielscher Ultrasound Technology	UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M	Heidolph Instruments		homogenizer
Urea	Carl Roth	57-13-6	CH4N2O
Vitamin B12	Sigma	68-19-9	C63H88CoN14O14P
Vitamin solution			0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment	VEOLIA water technologies	ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate	Sigma	7446-20-0	ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly	https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline	makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ		software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server	https://rast.nmpdr.org	input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater	0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium	artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+ liquid medium	f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar	3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar	3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution	0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution	0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin