Quantifier les interactions de liaison entre le Cu(II) et les résidus peptidiques en présence et en absence de chromophores

Résumé

Cet article se concentre sur l’utilisation de la spectroscopie d’absorption électronique et de la calorimétrie de titrage isotherme pour sonder et quantifier la thermodynamique de la liaison du Cu(II) aux peptides et aux protéines.

Résumé

Le cuivre(II) est un métal essentiel dans les systèmes biologiques, conférant des propriétés chimiques uniques aux biomolécules avec lesquelles il interagit. Il a été rapporté qu’il se lie directement à une variété de peptides et joue des rôles à la fois nécessaires et pathologiques allant de la structure médiatrice aux propriétés de transfert d’électrons en passant par la transmission de la fonction catalytique. La quantification de l’affinité de liaison et de la thermodynamique de ces complexes Cu(II)-peptide in vitro donne un aperçu de la force motrice thermodynamique de la liaison, des compétitions potentielles entre différents ions métalliques pour le peptide ou entre différents peptides pour Cu(II), et de la prévalence du complexe Cu(II)-peptide in vivo. Cependant, la quantification de la thermodynamique de liaison peut être difficile en raison d’une myriade de facteurs, y compris la prise en compte de tous les équilibres concurrents dans une expérience de titrage, en particulier dans les cas où il y a un manque de poignées spectroscopiques discrètes représentant le peptide, l’ion métallique d-bloc et leurs interactions.

Ici, un ensemble robuste d’expériences est fourni pour la quantification précise de la thermodynamique des peptides Cu(II). Cet article se concentre sur l’utilisation de la spectroscopie d’absorption électronique en présence et en l’absence de ligands chromophoriques pour fournir la poignée spectroscopique nécessaire sur Cu(II) et l’utilisation de la calorimétrie de titrage isotherme sans étiquette. Dans les deux techniques expérimentales, un processus est décrit pour tenir compte de tous les équilibres concurrents. Bien que cet article se concentre sur le Cu(II), l’ensemble d’expériences décrites peut s’appliquer au-delà des interactions Cu(II)-peptide et fournir un cadre pour une quantification précise d’autres systèmes métal-peptide dans des conditions physiologiquement pertinentes.

Introduction

La biologie a évolué pour utiliser la chimie diversifiée des ions métalliques nécessaires à l’adaptation et à la survie de la vie dans son environnement. On estime que 25% à 50% des protéines utilisent des ions métalliques pour la structure et la fonction¹. Le rôle particulier et l’état redox de l’ion métallique sont directement liés à la composition et à la géométrie des ligands biologiques qui le coordonnent. En outre, les ions métalliques redox-actifs tels que Cu(II) doivent être étroitement régulés de peur qu’ils n’interagissent avec les agents oxydants via une chimie de type Fenton pour former des espèces réactives de l’oxygène (ROS)^2,3,4. Comprendre les modes de liaison et l’affinité qui sous-tendent sa biochimie devrait aider à élucider le rôle biologique de l’ion métallique.

De nombreuses techniques sont utilisées pour étudier les interactions de liaison des métaux et des peptides. Il s’agit principalement de techniques spectroscopiques, mais elles comprennent également des simulations informatiques utilisant la dynamique moléculaire, comme en témoignent les interactions Cu(II) avec un fragment de bêta-amyloïde (Aβ)⁵. Une technique spectroscopique largement utilisée et accessible à de nombreuses universités est la résonance magnétique nucléaire (RMN). En utilisant la nature paramagnétique de Cu(II), Gaggelli et al. ont pu montrer où l’ion métallique se lie sur un pétide par relaxation des noyaux voisins⁶. La résonance paramagnétique électronique (EPR) peut également être utilisée pour sonder l’emplacement et le mode de liaison des ions métalliques paramagnétiques⁷. D’autres techniques spectroscopiques telles que le dichroïsme circulaire (CD) peuvent décrire la coordination autour de Cu(II) dans des systèmes tels que les systèmes tripeptides⁸, et la spectrométrie de masse peut montrer la stœchiométrie et les résidus auxquels l’ion métallique est coordonné par des modèles de fragmentation ^9,10.

Certaines de ces techniques, telles que la RMN, sont sans étiquette, mais nécessitent de grandes concentrations de peptides, ce qui pose des défis pour l’étude. Une autre technique courante appelée spectroscopie de fluorescence a été utilisée pour relier la position d’une tyrosine ou d’un tryptophane à la trempe à partir d’un Cu(II)^11,12. De même, cette technique peut montrer des changements structurels à la suite de la liaison Cu(II)¹³. Cependant, les défis avec ces études de liaison métal-peptide sont qu’ils sondent les acides aminés chromophoriques tels que la tyrosine que tous les systèmes n’ont pas, que l’ion métallique se lie sous un modèle classique, et que la technique peut ne pas être propice dans des conditions physiologiques. En effet, plusieurs peptides émergent qui ne contiennent pas de tels acides aminés chromophoriques ou se lient selon les modèles classiques, empêchant l’utilisation de ces techniques^14,15. Cet article détaille les approches pour évaluer les propriétés de liaison dans ces scénarios dans des conditions physiologiquement pertinentes.

Les ligands biologiques peuvent adopter différents états de protonation qui peuvent affecter la liaison aux ions métalliques tels que l’anneau imidazole sur l’histidine. Si le pH n’est pas maintenu de manière constante, les résultats peuvent être alambiqués ou contradictoires. Pour cette raison, les tampons sont un composant essentiel dans l’étude des interactions métal-protéine/peptide. Cependant, il a été démontré que de nombreux tampons interagissent favorablement avec les ions métalliques^16,17. En plus de rivaliser avec la molécule biologique d’intérêt, le tampon peut avoir des atomes de coordination similaires qui peuvent être difficiles à distinguer des atomes de coordination du peptide ou de la protéine. Dans cette étude, l’accent est mis sur la spectroscopie d’absorption électronique et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) en tant que deux techniques complémentaires pour étudier les interactions Cu(II)-peptide, avec des considérations particulières concernant le choix du tampon.

La spectroscopie d’absorption électronique est une technique rapide et largement accessible pour étudier les interactions de liaison des métaux. L’irradiation avec de la lumière dans les longueurs d’onde ultraviolettes (UV) ou visibles peut entraîner l’absorption de bandes d-d centrées sur le métal, qui fournissent des informations précieuses sur la classification des ligands, les géométries des métaux et les affinités de liaison apparentes^18,19. Pour ces complexes, les titrages directs d’ions métalliques dans des solutions protéiques ou peptidiques peuvent quantifier les stœchiométries de liaison et les affinités de liaison apparentes. Dans certains cas, comme les configurations d’électrons d⁵ ou d¹⁰, le complexe n’absorbe pas la lumière (c.-à-d. est spectroscopiquement silencieux). Dans ces complexes de métaux de transition spectroscopiquement silencieux, ces limitations peuvent être contournées en utilisant un ligand concurrent qui, lors de la coordination avec l’ion métallique, donne des bandes de transfert de charge détectables. Dans les deux cas, cette approche se limite à quantifier uniquement la stœchiométrie et l’affinité de liaison apparente, et aucun aperçu de l’enthalpie de liaison n’est fourni sans approximations.

Complétant les informations obtenues par spectroscopie d’absorption électronique, l’ITC est une technique attrayante pour la quantification directe et rigoureuse de l’enthalpie de liaison²⁰. L’ITC mesure directement la chaleur libérée ou consommée lors d’un événement de liaison et, puisque le titrage a lieu à pression constante, la chaleur mesurée est l’enthalpie de tous les équilibres (ΔH_ITC). De plus, la stœchiométrie de l’événement de liaison (n) et l’affinité de liaison apparente (K_ITC) sont quantifiées. À partir de ces paramètres, l’énergie libre (ΔG_ITC) et l’entropie (ΔS_ITC) sont déterminées, fournissant un instantané thermodynamique de l’événement de liaison. Comme il ne repose pas sur l’absorption de la lumière, l’ITC est une technique idéale pour les espèces spectroscopiquement silencieuses, par exemple, les complexes d’ions métalliques d⁵ ou d¹⁰ . Cependant, étant donné que la calorimétrie mesure la chaleur, tout système tampon non apparié et tout équilibre non comptabilisé peuvent nuire à l’analyse visant à déterminer avec précision la thermodynamique de liaison aux ions métalliques, et il faut prendre grand soin de traiter ces facteurs²⁰. S’il est effectué avec la rigueur appropriée, l’ITC est une technique robuste pour déterminer la thermodynamique des complexes métal-protéine/peptide.

Ici, un peptide de liaison au cuivre chromophoriquement silencieux, le C-peptide, est utilisé pour démontrer l’utilisation complémentaire des deux techniques. Le peptide C est un produit de clivage de 31 résidus (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formé pendant la maturation de l’insuline; il manque de résidus chromophoriques mais il a été démontré qu’il lie le Cu(II) avec une affinité physiologiquement pertinente^14,15. Le site de liaison Cu(II) est constitué des chaînes latérales d’un glutamate et d’un aspartate ainsi que du N-terminus du peptide^14,15. Ces atomes de coordination ressemblent beaucoup à ceux de nombreux systèmes tampons couramment utilisés. Ici, l’utilisation en tandem des bandes d-d et de transfert de charge en spectroscopie d’absorption électronique et ITC dans la quantification de la thermodynamique de liaison Cu(II) au peptide C est montrée. L’approche de l’étude de la liaison Cu(II) au peptide C peut être appliquée à d’autres ions métalliques et systèmes protéine/peptide.

Protocole

1. Spectroscopie d’absorption électronique : titrage direct avec compétition tampon

1. Préparation des échantillons
   1. Préparer une solution tamponnée de 50 mM de 2-[bis(2-hydroxyéthyl)amino]-2-(hydroxyméthyl)propane-1,3-diol (bisTris) à pH 7,4 en utilisant de l’eau ultrapure (résistance >18 MΩ). Éliminer les ions métalliques traces en incubant avec une résine à haute affinité pendant au moins 2 h avec filtration ultérieure.
   2. Dissoudre ou diluer une quantité connue du peptide dans le tampon sans métal.
      REMARQUE: Lors de la surveillance des bandes d-d avec de petits coefficients d’extinction²¹, des concentrations plus élevées de peptide doivent être utilisées. Ici, la concentration finale de C-peptide en solution tamponnée était de 300 μM (le volume dépend de la taille de la cuvette). Le peptide C a été synthétisé par synthèse peptidique en phase solide et est détaillé ailleurs dans la littérature¹⁴.
   3. Dissoudre une masse connue de CuCl₂ dans de l’eau ultrapure pour obtenir une solution à 10-15 mM.
      REMARQUE: Il est important de dissoudre initialement le sel métallique dans de l’eau sans tampon pour éviter les précipitations. D’autres sels de Cu(II) peuvent être utilisés, mais il faut veiller à ce que l’anion se coordonne faiblement.
2. Exécution de l’expérience
   1. Allumez le spectrophotomètre d’absorption électronique et laissez-le se réchauffer pendant environ 15 à 20 minutes avant utilisation. Lancez le logiciel du spectrophotomètre et configurez les paramètres tels que la plage de balayage (200-900 nm), la vitesse de balayage (200 nm/s) et la correction de la ligne de base à double faisceau (d’autres paramètres sont répertoriés dans le fichier supplémentaire).
   2. Prélever une ligne de base sans cuvettes ni échantillons dans les trajectoires de faisceau.
   3. À l’aide de deux cuvettes appariées dans le spectrophotomètre à double faisceau, chargez une cuvette avec 115 μL d’eau ultrapure et l’autre cuvette avec 115 μL de l’échantillon peptidique. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les cuvettes, car elles interféreront avec le signal.
   4. Placez la cuvette avec de l’eau ultrapure dans le faisceau de référence et la cuvette avec du peptide dans le faisceau d’échantillon.
   5. Recueillir le spectre d’absorption du peptide sans métal (apo).
   6. Ajouter une quantité sous-stœchiométrique (0,5 équivalent, 150 μM) de la solution de Cu(II) dans la cuvette avec l’échantillon peptidique. Assurez-vous que le volume de Cu(II) ajouté est inférieur à 3 μL et enregistrez le volume pour analyse ultérieurement.
   7. Pipettez doucement de haut en bas pour mélanger la solution tout en évitant la génération de bulles d’air. Laissez la solution réagir et équilibrer pendant 5 min et enregistrez le spectre d’absorption.
   8. Répéter l’ajout d’aliquotes de Cu(II) comme à l’étape 1.2.6 dans la solution peptidique pour les équivalents suivants : 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 et 5.0 (soit un total de 300, 450, 600, 900 et 1 500 μM). Assurez-vous d’enregistrer le volume total de Cu(II) ajouté et le volume total de la cuvette.
      REMARQUE: Si plus de résolution est souhaitée, réduisez l’espacement entre les équivalents.
   9. Retirez la cuvette d’échantillon et nettoyez soigneusement selon les instructions du fabricant.
   10. Ajouter la solution tamponnée sans peptide et enregistrer le spectre d’absorption. Répéter l’ajout de aliquotes de Cu(II) comme aux étapes 1.2.5-1.2.8, en enregistrant le spectre d’absorption pour chaque équivalent Cu(II).
   11. Exportez tous les spectres sous forme de fichiers csv pour le traitement. Nettoyez soigneusement les cuvettes selon les instructions du fabricant et mettez le spectrophotomètre hors tension.
3. Traitement des données
   1. Chargez tous les spectres sur un tableur.
   2. Soustrayez le spectre tampon uniquement (0 μM Cu(II)) de tous les autres spectres pour éliminer toute caractéristique d’absorbance du tampon lui-même.
   3. Normaliser chaque spectre pour tenir compte de la dilution résultant de l’ajout de la solution de Cu(II) (étape 1.2.6). Voir le fichier supplémentaire, Eq (1)¹⁴ pour un exemple de normalisation où v_initial est le volume (115 μL) de peptide ajouté à la cuvette, v_Cu(II) est le volume de solution de Cu(II) ajouté à l’étape 1.2.6, et abs_{buffer subtracted spectrum} est les données obtenues à l’étape 1.2.7.
   4. Représentez tous les spectres ensemble pour identifier les régions de changement.
      REMARQUE: Les bandes d-d typiques des complexes Cu (II) vont de 500 à 750 nm. Ce titrage spectrophotométrique peut être difficile en raison du faible coefficient d’extinction des bandes d-d, qui sont des transitions interdites par Laporte en géométrie octaédrique²¹. Si l’absorbance est trop faible, une autre approche consiste à utiliser des ligands chromophoriques qui entraînent des bandes de transfert de charge lors de la liaison au Cu(II) (voir rubrique 2).

2. Spectroscopie d’absorption électronique : compétition peptidique avec ligand chromophorique

1. Préparation des échantillons
   1. Dissoudre la 1,10-phénanthroline (phen) dans de l’eau ultrapure pour obtenir une concentration finale d’environ 1 mM.
   2. En plus de la préparation de l’échantillon décrite à la rubrique 1.1 pour le peptide (étape 1.1.2) et le Cu(II) (étape 1.1.3), préparer une solution de 10 μM Cu(II) et 40 μM de phén dans un tampon ([Cu(phen)₃]²⁺). Assurez-vous que le volume remplit la cuvette.
2. Exécution de l’expérience
   1. Démarrez le spectrophotomètre d’absorption électronique comme dans les étapes 1.2.1 et 1.2.2, mais réglez la plage de balayage sur 200-400 nm.
   2. Dans deux cuvettes appariées, charger une cuvette avec 115 μL d’eau ultrapure et l’autre cuvette avec 115 μL de la solution [Cu(phen)₃]²⁺ . Placer la cuvette avec de l’eau dans le faisceau de référence et la cuvette avec la solution [Cu(phen)₃]²⁺ dans le faisceau d’échantillonnage.
   3. Recueillir le spectre d’absorption du complexe métal-ligand.
   4. Ajouter une quantité stœchiométrique (équivalents ≈1, ≈10 μM) de peptide à la solution [Cu(phen)₃]²⁺ . Pipettez doucement de haut en bas pour bien mélanger, mais veillez à ne pas introduire de bulles d’air. Enregistrez le volume de peptide ajouté pour une analyse future.
      REMARQUE: En utilisant des cuvettes qui contiennent 115 μL, l’ajout de 3,83 μL de 300 μM peptide donne une concentration finale de peptide de 9,7 μM.
   5. Incuber la solution pendant 5 min pour atteindre l’équilibre. Enregistrez le spectre d’absorption.
      REMARQUE: Si l’affinité de liaison du métal-peptide et du métal-ligand est similaire, la concentration de peptide ajouté devra être en excès important. Assurez-vous de tenir compte du volume total de peptide ajouté pour la normalisation.
   6. Répétez l’addition d’aliquotes peptidiques dans la solution [Cu(phen)₃]²⁺ pour les équivalents approximatifs suivants : 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 et 26. Enregistrez le volume de peptide ajouté afin que la concentration diluée puisse être déterminée.
   7. Retirez l’échantillon et nettoyez soigneusement la cuvette conformément aux instructions du fabricant. Collectez un spectre du tampon. Recueillir un spectre de peptides de 50 μM dans le tampon.
   8. Exportez toutes les données sous forme de fichiers csv pour le traitement et nettoyez les cuvettes conformément aux instructions du fabricant.
3. Traitement des données
   1. Chargez les spectres sur un tableur et soustrayez le spectre tampon des autres spectres.
   2. Normalisez les spectres après le fichier supplémentaire, Eq (2)¹⁴.
   3. En utilisant le coefficient d’extinction pour [Cu(phen)₃]²⁺ à 265 nm (ε_max = 90 000 ^{M-1 cm-1})²², déterminer la concentration de [Cu(phen)₃]²⁺ à chaque ajout du peptide.
   4. Pour chaque addition du peptide, déterminer la concentration du complexe Cu(II)-peptide en soustrayant la concentration restante de [Cu(phen)₃]²⁺, telle que déterminée à l’étape 2.3.2, de la concentration initiale de [Cu(phen)₃]²⁺ (à 0 μM peptide).
   5. Calculer la concentration de ligand phen libre par l’équation dans le fichier supplémentaire, Eq (3)¹⁴.
   6. Calculer la concentration de peptide libre à l’aide du fichier supplémentaire Eq (4)¹⁴, où [peptide]_stock représente le peptide non dilué titré dans la cuvette, V₁ représente le volume de peptide stock ajouté, V₂ est le volume total de la cuvette et [Cu²⁺-peptide] est déterminé à l’étape 2.3.4.
   7. Calculer l’affinité de liaison expérimentale (K_ex) à l’aide de Eq (5) dans le fichier^{supplémentaire 23}.
   8. Relier la constante de dissociation du peptide Cu(II) à K_ex par Eq (6)²³ dans le fichier supplémentaire, où K_{d,Cu(II)-phen} = 1,0 × 10-9 (voir ²²). Déterminer la moyenne et l’écart-type par rapport à toutes les constantes de dissociation déterminées.
      REMARQUE: Sous un rapport 4: 1 de phen: Cu (II), [Cu (phen) ₃] ^{2 +}, [Cu (phen) ₂] ²⁺ et [Cu (phen)]²⁺ existent dans la solution, et le peptide chélatera Cu (II) loin de l’espèce ([Cu (phen)]²⁺) avec la liaison la plus faible²².

3. Calorimétrie de titrage isotherme

1. Préparation des échantillons
   1. Préparer une solution tamponnée d’acide 3-morpholinopropane-1-sulfonique (MOPS) de 15 mM à pH 7,4 en utilisant de l’eau ultrapure (résistance >18 MΩ). Éliminez les traces d’ions métalliques en incubant avec une résine à haute affinité pendant au moins 2 h avec filtration sous vide ultérieure à travers une membrane de 0,45 μm sur le dessus de la bouteille.
   2. Dissoudre une masse connue de CuCl₂ dans de l’eau ultrapure pour préparer une solution de ≈50-100 mM. Diluer cette solution de Cu(II) dans un tampon pour obtenir une solution de 1,0 mL avec une concentration finale de 1,4 mM Cu(II). Enregistrez le volume exact de la solution CuCl₂ utilisée.
   3. Dissoudre ou diluer la solution peptidique dans un tampon pour obtenir 450 μL d’une solution peptidique de 154 μM. Assurez-vous que la même proportion d’eau ultrapure supplémentaire de l’étape 3.1.2 est ajoutée à la solution peptidique, ce qui réduira la chaleur de dilution et augmentera le signal au bruit.
   4. Après la préparation des échantillons, assurez-vous que les solutions ont le même pH et, si nécessaire, ajustez-les en conséquence.
   5. Étape optionnelle : Dégazez les solutions pour minimiser les microbulles chargées dans l’ITC.
2. Exécution de l’expérience
   1. Activez l’ITC. Lancez le logiciel ITC pour exécuter l’instrument. Attendez la première initialisation, qui demandera de reloger le buret; ensuite, suivez les instructions à l’écran.
   2. Retirez le capot de la cellule de référence. Retirez toute eau de la cellule de référence et rincez trois fois avec 450 μL d’eau ultrapure dégazée.
   3. Aspirez lentement l’eau ultrapure jusqu’à la marque de 450 μL d’une seringue de chargement, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air dans la seringue. Insérez la seringue de chargement dans la cellule de référence jusqu’à ce qu’elle soit ≈1 mm du fond et injectez lentement une partie de la solution jusqu’à ce qu’il reste 150 μL dans la seringue de chargement. Déplacez rapidement le piston de la seringue de chargement de haut en bas de ≈25 μL plusieurs fois pour déloger les bulles à la surface de la cellule. Injecter lentement jusqu’à ce que le piston atteigne la marque de 100 μL sur la seringue de chargement, distribuant ainsi un total de 350 μL d’eau ultrapure dans la cellule de référence, et remplacez le couvercle de la cellule de référence.
   4. Retirer toute solution résiduelle de la cellule d’échantillonnage et charger avec 450 μL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 10 mM à l’aide d’une seringue de chargement. Faire tremper pendant 10 minutes pour s’assurer que les ions métalliques traces sont éliminés, car l’EDTA liera les métaux traces.
   5. Retirez la solution d’EDTA (avec des ions métalliques traces liés) et rincez soigneusement la seringue de chargement avec de grandes quantités d’eau ultrapure.
   6. Nettoyez l’ITC conformément aux instructions du fabricant, en rinçant la cellule d’échantillon avec de l’eau ultrapure.
   7. Conditionnez la cellule de l’échantillon en rinçant avec 450 μL de tampon au moins trois fois.
   8. Retirez le tampon qui conditionne la cellule d’échantillonnage. Chargez la solution peptidique dans la cellule de l’échantillon à l’aide de la seringue de chargement (suivez l’étape 3.2.3).
   9. Rincez la seringue de titrage avec 200 μL de solution tamponnée. Pour ce faire, retirez le piston et utilisez une micropipette pour pipeter le tampon à travers le trou en haut de la seringue de titrage en verre, à travers la seringue et à l’aiguille en dessous.
   10. Insérez complètement le piston dans la seringue de titrage.
   11. Trempez l’extrémité de l’aiguille de la seringue de titrage dans la solution métallique et tirez lentement le piston vers le haut, ce qui fait que la solution métallique remplit la seringue et entraîne un volume vide au sommet de la partie en verre de la seringue de titrage. Retirez la majeure partie du volume vide en faisant pivoter la seringue de titrage parallèlement au sol, retirez le piston et inclinez légèrement la partie en verre vers le sol. Agitez doucement la seringue de titrage afin que la solution se déplace vers l’extrémité de la partie en verre de la seringue de titrage et remplisse la majeure partie du volume du vide, mais assurez-vous qu’il reste 2 à 3 μL de volume de vide. Tout en gardant la seringue parallèle au sol, réinsérez le piston.
   12. Tenez la seringue de titrage à la verticale, trempez l’extrémité de l’aiguille dans la solution métallique et poussez le piston vers le bas jusqu’à ce que l’air cesse de sortir de l’aiguille. Chargez la seringue de titrage en tirant lentement le piston juste au-dessus de la marque de 50 μL tout en maintenant le bout de l’aiguille dans la solution.
   13. Insérez soigneusement la partie en verre de la seringue de titrage dans le buret et vissez jusqu’à ce qu’elle soit serrée au doigt. Lorsqu’une petite quantité de solution sort de la seringue de titrage en raison de la compression du piston, utilisez un essuie-glace délicat léger pour absorber soigneusement la solution sans toucher le bout de l’aiguille.
   14. Insérez le buret avec une seringue de titrage dans la cellule de l’échantillon et fixez-le solidement.
   15. Configurez les paramètres sur le logiciel ITC. À partir de Instrument Control, réglez la vitesse d’agitation (les vitesses d’agitation typiques vont de 150 à 350 tr / min) et la température à laquelle l’expérience sera menée (généralement 25 ° C). Entrez les concentrations de seringues et de cellules en unités millimolaires sous Détails de l’expérience.
   16. Dans la section Méthode expérimentale , sélectionnez Titrage incrémentiel. Cliquez sur Configuration et spécifiez 20 injections de 2,5 μL. Si une plus grande résolution est nécessaire pour observer l’événement de liaison, augmentez le nombre d’injections et diminuez le volume par injection. Entrez l’espacement temporel entre chaque injection afin qu’il soit suffisamment long pour que le signal s’équilibre et revienne à la ligne de base, généralement 300 s.
   17. Cliquez sur le bouton Exécuter pour démarrer l’expérience et spécifier l’emplacement d’enregistrement des données.
   18. À la fin de l’expérience, nettoyez la cellule d’échantillon et la seringue de titrage.
   19. Exécutez toutes les expériences en trois exemplaires au moins pour assurer une collecte de données précise.
   20. Exécutez une expérience de contrôle où la solution métallique est titrée dans la solution tamponnée (en l’absence de peptide) pour s’assurer que la chaleur de dilution de l’ion métallique est faible et qu’il n’y a pas d’équilibres non comptabilisés. Si la chaleur de dilution est importante, envisagez un système tampon différent, si possible.
3. Traitement des données
   1. Lancez le logiciel d’analyse ITC et chargez le fichier de données pour analyse.
   2. Accédez à l’onglet Configuration de référence et inspectez le thermogramme. Notez toute chaleur exogène produite ou absorbée par des bulles d’air ou d’autres artefacts dans le thermogramme. Recherchez les pointes qui ne sont pas dues à l’injection de la solution métallique.
   3. Assurez-vous que la ligne de base générée par le logiciel d’analyse suit la partie des données après l’injection et l’équilibrage. S’il s’écarte, utilisez les points pivot de la ligne de base pour ajuster la configuration de référence. Assurez-vous que les régions d’intégration incluent le pic généré par l’injection du métal, mais obstruent les bulles d’air ou les artefacts dans le thermogramme trouvés à l’étape 2. Soustrayez la ligne de base du thermogramme.
      REMARQUE: Ce type de manipulation n’est recommandé qu’après la collecte de plusieurs thermogrammes, afin que l’expérimentateur sache ce qui est des données réelles et ce qui est un artefact, car l’ajustement de la ligne de base et des régions d’intégration peut affecter considérablement les données.
   4. Accédez à la fenêtre Modélisation pour commencer à ajuster les données où le logiciel d’analyse affichera les données intégrées et normalisées par concentration pour chaque injection.
   5. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur la référence de la première injection pour la retirer de l’algorithme d’ajustement.
      REMARQUE: Ceci est courant car il y aura un mélange mineur entre le titrant et la solution de cellules d’échantillon conduisant à une distribution molaire inexacte de la première injection.
   6. Dans la section Modèles , sélectionnez Vide (constante) dans le menu déroulant Style , qui est basé sur l’enthalpie d’injection finale et sera soustrait de chaque point de données, en tenant compte de la chaleur de dilution. En outre, sélectionnez Indépendant (ou le meilleur modèle pour le système) dans le deuxième menu déroulant Style pour adapter les données.
      REMARQUE : Pour les interactions de liaison 1:1 standard, le modèle le plus courant est Indépendant.
   7. Ajustez les données à l’aide des deux modèles en appuyant sur le bouton de lecture vert avec un Σ.
      REMARQUE: Un autre logiciel pour traiter les données ITC est SEDPHAT²⁴.
   8. Tenir compte de tous les équilibres concurrents dans l’analyse post hoc précédemment rapportée par Grossoehme et al. ²⁰.

Résultats

L’objectif était de quantifier et de corroborer la thermodynamique de la liaison du Cu(II) au peptide C en utilisant les techniques complémentaires de spectroscopie d’absorption électronique et d’ITC. En raison de la nature robuste de la spectroscopie d’absorption électronique, un titrage direct de Cu(II) en peptide C de 300 μM a été effectué (Figure 1). L’ajout de 150 μM de Cu(II) a provoqué une augmentation immédiate de la bande à 600 nm, attribuée à la bande d-d de...

Discussion

Cet article fournit une méthode robuste pour quantifier l’affinité et la thermodynamique de la liaison cu(II) aux peptides. Les complexes avec Cu(II) sont parfaitement adaptés pour surveiller la bande d’absorption d-d sur le site métallique en raison de sa configuration électronique d⁹ . Bien que le coefficient d’extinction soit faible, nécessitant ainsi de plus grandes concentrations du complexe pour produire un signal fiable, les titrages de Cu(II) en peptide peuvent rapidement fournir un aperçu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,10-phenanthroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris buffer	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane	Nalgene	296-4545	Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer	Varian	Cary 5000	Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin	Sigma Aldrich	C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Low Volume
ITC analysis software	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software	TA Instruments	ITCRun
light-duty delicate wiper	Kimwipe	34155
loading syringe	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer	Alfa Aesar	A12914
spectrophotometer software	Cary	WinUV Scan
spreadsheet program	Microsoft	Excel	Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe	TA Instruments	5346
ultrapure water	Millipore Sigma	Milli-Q	Any water is okay as long as >18 MΩ resistance