Élevage de masse et études moléculaires chez les insectes nuisibles tortricidae

Résumé

Le présent protocole décrit la méthode d’élevage des insectes ravageurs tortricides dans les laboratoires. Les procédures permettant de distinguer le sexe des insectes et d’extraire les acides nucléiques pour le séquençage à haut débit sont établies à l’aide de deux ravageurs tortricides.

Résumé

Les tortricidae (lépidoptères), communément appelés tortrix ou tordeuses, comprennent de nombreux ravageurs agricoles et forestiers, qui causent de graves pertes agricoles. Pour comprendre la biologie de ces papillons nuisibles, les techniques fondamentales ont été très demandées. Ici, des méthodes d’élevage de masse, d’observations et d’études moléculaires sont développées à l’aide de deux tortrix de thé, Homona magnanima et Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Les insectes ont été élevés en masse avec un régime artificiel tranché et maintenus par consanguinité pendant plus de 100 générations en tenant compte de leurs caractéristiques biologiques. Les insectes ont divers dimorphismes sexuels; par conséquent, il est difficile de distinguer le sexe pendant les stades de développement, qui ont empêché les tests ultérieurs. Le présent travail a mis en évidence que le sexe des larves de tortricides pouvait être déterminé en observant les testicules ou la coloration lactique-acétique de l’orcéine pour visualiser le chromosome W spécifique à la femelle. De plus, en utilisant les méthodes de détermination du sexe, la présente étude a permis d’extraire des acides nucléiques d’embryons déterminés par le sexe et de les appliquer au séquençage à haut débit. Ces conseils sont applicables à d’autres insectes nuisibles et faciliteront d’autres études morphologiques et génétiques.

Introduction

Les insectes lépidoptères représentent plus de 10 % de toutes les espèces vivantes décrites¹, et certaines espèces de taxons causent de graves dommages aux plantes et de graves pertes agricoles ^2,3. Bien que des études moléculaires et génétiques aient été développées à l’aide d’insectes modèles tels que le ver à soie Bombyx mori ^4,5, les insectes nuisibles n’ont pas encore fait l’objet d’enquêtes, en partie à cause des difficultés d’élevage et de manipulation ^6,7.

Protocole

1. Collecte d’insectes et élevage de masse

1. Collectez des insectes tortricides dans les champs en suivant les références ^8,12 publiées précédemment.
   REMARQUE : Les larves de H. magnanima et d’A. honmai sont prélevées sur des feuilles de thé endommagées (figure 1A); les adultes sont attirés par la lumière UV portable de 4 W (longueur d’onde de 365 nm, voir tableau des matériaux, figure 1B).
2. Élevez les larves recueillies (Figure 1C,D)....

Résultats

Mise en place des lignes hôtes et leur maintenance
La viabilité des larves collectées sur le terrain est attribuée différemment à l’emplacement, aux saisons et aux conditions d’élevage sur le terrain (p. ex., 90 % de la viabilité à Taïwan, Taoyuan, comme le montrent Arai et ^al.12). Environ 30% à 50% des paires généreront la prochaine génération comme d’habitude. Pour H. magnanima et A. honmai, les matrilines sont maintenues par consanguini.......

Discussion

Tortricid comprend plusieurs ravageurs agricoles et forestiers; la présente étude a présenté des méthodes pour élever la tortrix au fil des générations, observer l’embryogenèse et le sexe des insectes, et effectuer une analyse moléculaire à l’aide d’embryons matures.

L’un des obstacles à l’étude des insectes nuisibles est d’établir des méthodes d’élevage. En particulier, la consanguinité affecte parfois négativement la condition physique de l’espèce. La rédu.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 ounce cup	FP CHUPA	CP070009	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lid	FP CHUPA	CP070011	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	36289	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kit	Agilent Technologies	5067-1511	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf
benzalkonium chloride solution	Nihon Pharmaceutical Co., Ltd	No.4987123116046	Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
Cotton	AOUME	8-1611-02	insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
DAPI solution	Dojindo, Tokyo, Japan	340-07971	stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Disodium Hydrogenphosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
dsDNA HS quantification kit	Invitrogen	Q33231	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Econospin RNA II column	Epoch Life Science Inc.	EP-11201	RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
Ethanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA)	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Glassine paper	HEIKO	2100010	insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCK	ATTO, Tokyo, Japan	4002620	incubation; https://www.attoeng.site/
heptane	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LF	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
ISOGENII	Nippon Gene	311-07361	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
isopropanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Lactic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
methanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 vortex	Biosan	BS-010210-TAK	Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80	Implen	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wide	Inomata chemical	1859	insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7770S	Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orcein	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
Paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	160-16061	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength)	Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan	not shown	Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen Phosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen, MA, USA	P36965	antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K Solution	Merck	71049-4CN	DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solution	Qiagen	158912	DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4	Invitrogen	Q33238	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicin	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kit	Invitrogen	Q32855	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solution	Nippon Gene	313-01461	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2S	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water	Invitrogen	10977023	RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015