Élevage de masse et études moléculaires chez les insectes nuisibles tortricidae

Résumé

Le présent protocole décrit la méthode d’élevage des insectes ravageurs tortricides dans les laboratoires. Les procédures permettant de distinguer le sexe des insectes et d’extraire les acides nucléiques pour le séquençage à haut débit sont établies à l’aide de deux ravageurs tortricides.

Résumé

Les tortricidae (lépidoptères), communément appelés tortrix ou tordeuses, comprennent de nombreux ravageurs agricoles et forestiers, qui causent de graves pertes agricoles. Pour comprendre la biologie de ces papillons nuisibles, les techniques fondamentales ont été très demandées. Ici, des méthodes d’élevage de masse, d’observations et d’études moléculaires sont développées à l’aide de deux tortrix de thé, Homona magnanima et Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Les insectes ont été élevés en masse avec un régime artificiel tranché et maintenus par consanguinité pendant plus de 100 générations en tenant compte de leurs caractéristiques biologiques. Les insectes ont divers dimorphismes sexuels; par conséquent, il est difficile de distinguer le sexe pendant les stades de développement, qui ont empêché les tests ultérieurs. Le présent travail a mis en évidence que le sexe des larves de tortricides pouvait être déterminé en observant les testicules ou la coloration lactique-acétique de l’orcéine pour visualiser le chromosome W spécifique à la femelle. De plus, en utilisant les méthodes de détermination du sexe, la présente étude a permis d’extraire des acides nucléiques d’embryons déterminés par le sexe et de les appliquer au séquençage à haut débit. Ces conseils sont applicables à d’autres insectes nuisibles et faciliteront d’autres études morphologiques et génétiques.

Introduction

Les insectes lépidoptères représentent plus de 10 % de toutes les espèces vivantes décrites¹, et certaines espèces de taxons causent de graves dommages aux plantes et de graves pertes agricoles ^2,3. Bien que des études moléculaires et génétiques aient été développées à l’aide d’insectes modèles tels que le ver à soie Bombyx mori ^4,5, les insectes nuisibles n’ont pas encore fait l’objet d’enquêtes, en partie à cause des difficultés d’élevage et de manipulation ^6,7. Par conséquent, des études et des techniques fondamentales sont nécessaires pour comprendre la biologie de ces insectes nuisibles non modèles.

Les Tortricidae (Lépidoptères), communément appelés tortrix ou tordeuses, comprennent de nombreux ravageurs agricoles et forestiers⁸. Parmi les taxons d’insectes, la tortrix de thé orientale Homona magnanima Diakonoff et la tortrix de fruits d’été Adoxophyes honmai Yasuda sont de graves ravageurs polyphages connus pour endommager les théiers en Asie de l’Est⁷. Les deux espèces pondent des grappes d’œufs plates et ovales en forme d’écailles (ou masses d’œufs) constituées d’œufs minces, mous et fragiles recouverts de sécrétions maternelles. Bien que les stades de l’embryogenèse soient cruciaux pour le développement des insectes et la détermination du sexe⁹, les structures des œufs empêchent une analyse plus approfondie de comprendre la biologie des insectes. Il est important de surmonter les difficultés pour une étude plus approfondie sur les ravageurs ovipositant une masse d’œufs aussi complexe.

Ici, pour comprendre la biologie des tortricides, des méthodes d’élevage de masse, des observations et des études moléculaires ont été développées à l’aide de A. honmai et H. magnanima. Tout d’abord, les méthodes d’élevage de masse maintiennent les deux tortricides sur 100 générations par consanguin. La séparation des œufs de la masse d’œufs concaténée en forme d’écailles a facilité l’observation de l’embryogenèse des tortricides à l’aide de solvants alcalins et organiques précédemment développés à partir de techniques utilisées chez les mouches¹⁰. En outre, la présente étude a établi la discrimination sexuelle des petits embryons en développant des méthodes de coloration de la chromatine sexuelle des femelles lépidoptères utilisant l’orcéine lactique-acétique¹¹. En combinant ces méthodes, des acides nucléiques de haute qualité et de grande quantité ont été extraits d’embryons déterminés par le sexe, ce qui était autrement difficile à établir⁶. L’ARN extrait a été utilisé pour le séquençage de nouvelle génération. Collectivement, les méthodes présentées ici s’appliquent à d’autres insectes lépidoptères et à d’autres taxons d’insectes.

Protocole

1. Collecte d’insectes et élevage de masse

1. Collectez des insectes tortricides dans les champs en suivant les références ^8,12 publiées précédemment.
   REMARQUE : Les larves de H. magnanima et d’A. honmai sont prélevées sur des feuilles de thé endommagées (figure 1A); les adultes sont attirés par la lumière UV portable de 4 W (longueur d’onde de 365 nm, voir tableau des matériaux, figure 1B).
2. Élevez les larves recueillies (Figure 1C,D) individuellement sur un morceau de régime artificiel dans une tasse de 1/2 oz pendant 2-3 semaines jusqu’à l’éclosion adulte (Figure 1E,F). Confirmer le sexe des nymphes et des adultes par des traits morphologiques (Figure 1G,I).
3. Accoupler les mâles et les femelles dans une boîte en plastique (30 cm x 20 cm x 5 cm) pour ovipositer des masses d’œufs sur un papier paraffine (Figure 1J-L). Placez une femelle et deux mâles dans un gobelet en plastique de 120 ml avec un morceau de papier paraffine pour établir une matriline.
   REMARQUE: Il est important de faire des plis sur le papier paraffine. Pour H. magnanima, le papier paraffine doit être au fond du boîtier. Pendant ce temps, pour A. honmai, mettez un papier sur le plafond du boîtier pour collecter les œufs (Figure 1L) puisque H. magnanima oviposit la masse d’œuf sur la face supérieure des feuilles de thé, mais A. honmai pond des œufs sur la face inférieure des feuilles⁸. Les procédures ont également été vérifiées chez d’autres espèces de tortricides, et il est préférable de placer des papiers des deux côtés si l’écologie et le comportement des espèces cibles ne sont pas clarifiés.
4. Découpez les masses d’œufs (environ 100 à 200 œufs par masse d’œuf¹², figure 1M) sur le papier paraffine avec des ciseaux. Placez les œufs dans une tasse de 1/2 oz avec du papier jeté pendant 5 à 7 jours.
   REMARQUE : L’embryon mature présente une capsule de points noirs (Figure 1N). Les périodes d’embryogenèse sont diversement attribuées aux espèces de tortricides, mais généralement 5 jours après la ponte (dpo) pour H. magnanima et 4 dpo pour A. honmai à 25 °C avec 60% d’humidité relative, 16 h de lumière/8 h de cycles^{sombres 7}.
5. Conservez les masses d’œufs montrant des capsules de tête noire à 4-8 ° C pendant 7 jours.
6. Trancher ~ 60 g de régimes artificiels à l’aide d’une râpe pour l’élevage de masse. Placez la masse d’œufs remplie d’embryons mûrs sur le régime artificiel tranché dans un récipient en plastique (23 cm x 16 cm x 8 cm). Placez des papiers de paraffine sur la masse d’œufs avec les régimes tranchés (Figure 10).
   REMARQUE: Une humidité relative inférieure à 30% est considérée comme trop sèche, tandis que plus de 70% est trop humide. Créer des trous sur le couvercle du récipient en plastique est préférable pour permettre une meilleure ventilation. Remplissez les trous avec du coton pour empêcher les fuites de petites larves.
7. Pour éliminer les contaminants de surface des œufs, faire tremper la masse d’œufs dans une solution de formol à 3 % et de chlorure de benzalkonium à 0,2 % pendant 5 min, respectivement¹². Pour éradiquer les bactéries intestinales ou intracellulaires, utilisez un régime artificiel complété par du chlorhydrate de tétracycline à 0,05 % (p/p) ou de rifampicine à 0,06 % (p/p) au lieu d’un régime artificiel normal (voir tableau des matériaux).
   REMARQUE : cette étape est facultative. Il est important de pétrir Silk Mate 2S et 0,05% (p / p) de chlorhydrate de tétracycline ou 0,06% (p / p) de rifampicine de manière égale pour la consistance.
8. Recueillir les nymphes dans le récipient en plastique et distinguer le sexe en fonction de¹² caractéristiques morphologiques (Figure 1G-I).
   REMARQUE: Généralement, les tortricides présentent 5-6 instars jusqu’à la nymphose¹². Les larves de H. magnanima et d’A. honmai prennent respectivement 3 semaines et 2 semaines après l’éclosion jusqu’à la nymphose.
9. Placez 15 mâles et 10 femelles dans une boîte en plastique (30 cm x 20 cm x 5 cm, Figure 1K) pour l’accouplement à 25 °C, 16 L/8 D. Prélevez les œufs tous les 5-7 jours et répétez les étapes 1.4-1.9. pour chaque génération.
   REMARQUE: Si la collecte de masses d’œufs nouvellement ovipositifs pour une analyse ultérieure est nécessaire, définissez le début et la fin de la période sombre, par exemple de 9 h à 17 h. Dans cette condition, H. magnanima et A. honami oviposit généralement des œufs après 5 h (14 h).

2. Séparation des œufs et des larves pharate des masses d’œufs pour la fixation, la perméabilisation et la coloration

1. Faire tremper la masse d’œufs dans 1 000 μL de solution aqueuse d’hypochlorite de sodium à 1,2 % pendant 10 min ou dans 1 000 μL de solution aqueuse d’hydroxyde de potassium 5 M pendant 30 min pour séparer les œufs.
2. Laver les œufs séparés dans 1 000 μL de PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 0,05 % de polyoxyéthylène (20) monolaurate de sorbitan [Tween-20] pH 7,4, voir table des matières) à la suite du rapport publié précédemment⁷.
3. Faire tremper les œufs dans un mélange de 500 μL de solution à 100 % d’heptane et de 500 μL de solution de paraformaldéhyde-PBSt à 4 % (p/v). Mélanger pendant 10 min à 1 500 tr/min à l’aide d’un mélangeur vortex.
4. Faire tremper les œufs dans un mélange de 500 μL de 100 % d’heptane et de 500 μL de 100 % de méthanol. Mélanger pendant 10 min à 1 500 tr/min.
5. Laver les œufs deux fois avec 1 000 μL de méthanol à 100 % et les conserver à 4 °C dans du méthanol à 100 % jusqu’à ce que d’autres expériences soient effectuées (figure 2A).
   REMARQUE: Les œufs peuvent être conservés pendant au moins 1 an à 4 °C.
6. Faire tremper les œufs séquentiellement dans de l’éthanol à 99 %, 70 %, 50 % et PBSt pendant 5 min chacun pour l’hydrophilisation à la suite du rapport⁷ publié précédemment.
7. Lavez les œufs avec du PBSt, immergez-les dans 1 μg/mL de solution de DAPI pendant 5 min, puis lavez les œufs avec 1x PBS deux fois. Faire tremper les œufs dans 20 μL de solution d’orcéine lactique-acétique à 1,25 % (p/p) (voir Tableau des matériaux)¹¹ pour visualiser l’hétérochromatine jusqu’à ce que les noyaux présentent une couleur rouge brillant (cela varie de 5 à 60 min) (Figure 2B, C).
   REMARQUE: Les périodes de coloration lactique-acétique de l’orcéine dépendent de la température et de l’humidité. Il est préférable de vérifier la coloration appropriée à l’aide d’un microscope avec un grossissement 4x-10x.
8. Transférer les œufs tachés à l’aide d’une pipette sur une lame de verre. Entourer les œufs colorés d’un réactif antifade (voir Tableau des matériaux) et d’un verre de couverture⁷.
9. Extraire les larves de H. magnanima et d’A. honmai (4 à 5 jours après la ponte (dpo)) des masses d’œufs à l’aide d’une pince (Figure 2D). Couper les larves en deux sur une lame de verre (Figure 2E).
10. Fixez tous les tissus (p. ex., ganglion sous-œsophagien, ganglions thoraciques, tubule malpighien, etc.) avec un mélange de 1:3 (v/v) 99,7 % d’acide acétique et de méthanol à 100 % pendant 5 min. Colorez ceux qui ont une solution d’orcéine lactique-acétique¹¹ à 1,25% (p / p) jusqu’à ce que les noyaux soient colorés (cela peut prendre 5 à 60 minutes, selon la température et l’humidité).
11. Déterminer le sexe de chaque spécimen en observant la présence (femelle) ou l’absence (mâle) d’hétérochromatine (le chromosome W, Figure 2F,G) au microscope.
    REMARQUE: Le sexe est déterminé en visualisant la chromatine sexuelle. Chaque cellule représente la chromatine sexuelle sous forme de point chez les femelles^11,12, tandis que la partie restante des tissus larvaires pharates (non fixés) doit être immédiatement immergée dans le tampon de lyse cellulaire¹² (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA et 1% SDS, pH 8,0) ou des réactifs d’extraction d’ARN contenant du phénol pour l’extraction de l’ADN ou de l’ARN. Avant les dissections, distribuer à l’avance 20 μL des réactifs dans des tubes PCR de 0,2 mL (figure 3A). Immerger et conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à une extraction ultérieure. Les échantillons peuvent être conservés pendant au moins 3 mois, mais il est préférable de procéder aux expériences en aval pour éviter la dégradation des acides nucléiques.

3. Extractions d’ADN et d’ARN de larves pharate déterminées par le sexe

1. Regrouper 12 larves de pharate mâle ou femelle déterminées par le sexe (embryon de 5 dpo) et ajouter un tampon de lyse cellulaire ou des réactifs d’extraction d’ARN (voir l’étape 2.11 et la table des matières) dans un tube de 1,5 mL.
   REMARQUE: Suivez les étapes 3.2-3.7 pour l’extraction de l’ADN et les étapes 3.8-3.11 pour l’extraction de l’ARN.
2. Homogénéiser les tissus dans 600 μL du tampon de lyse cellulaire (10 mM tris-HCl, 100 mM EDTA et 1 % de FDS, pH 8,0), et centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
3. Recueillir le surnageant (500 μL) à l’aide d’une pipette et incuber à 50 °C avec 1,5 μL de protéinase K (20 mg/mL, voir Tableau des matériaux) pendant 5 h sur un bloc thermique.
4. Traiter les échantillons avec 1,0 μL de 10 mg/mL de solution de RNase (voir tableau des matériaux) à 37 °C pendant 30 min.
5. Ajouter 200 μL de solution de précipitation protéique (voir tableau des matériaux) dans les tubes⁷, puis une centrifugeuse à 17 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
6. Mélanger le surnageant (500 μL) avec 500 μL d’isopropanol à 100 %, puis centrifuger à 20 400 x g pendant 10 min à 4 °C.
7. Lavez l’ADN granulé deux fois avec 1 000 μL d’éthanol à 70 %. Ensuite, sécher à l’air libre (5-10 min à température ambiante), dissoudre l’ADN dans 30 μL de tampon Tris-Cl de 10 mM (pH 8,5).
8. Homogénéiser les tissus dans 600 μL de réactifs d’extraction d’ARN et ajouter 240 μL d’eau distillée ultra-pure au tube. Centrifuger les tubes à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
9. Mélanger le surnageant (600 μL) avec 600 μL d’isopropanol à 100 % et transférer le mélange dans une colonne de spin de silice (voir Tableau des matériaux). Centrifuger les tubes à 17 900 x g pendant 1 min à 4 °C.
10. Lavez la colonne avec 750 μL d’éthanol à 70 % et centrifugez la colonne deux fois à 17 900 x g pendant 1 min chacune à 4 °C.
11. Chargez 15 μL d’eau distillée ultra-pure dans la colonne. Centrifuger les tubes à 17 900 x g pendant 1 min à 4 °C pour éluer l’ARN.
12. Calculez et vérifiez la qualité et la quantité d’ADN et d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre UV. Évaluer la pureté des acides nucléiques à l’aide des rapports A260/A280 (acides nucléiques/protéines) et A260/A230 (acides nucléiques/sels et autres contaminants)¹³.
    REMARQUE : Pour l’extraction de l’ARN, la procédure¹² publiée précédemment a été suivie, ce qui a entraîné une contamination par le phénol (tableau 1). L’ADN et l’ARN extraits d’un seul embryon ou de larves pharates donnent des échantillons de faible quantité et de mauvaise qualité. En règle générale, l’extraction de l’ADN de 12 larves pharate donne 100 à 600 ng, tandis que l’extraction de l’ARN à l’aide de la méthode actuelle génère 900 à 1 500 ng, comme le montre le tableau 1.
    REMARQUE : Les étapes 3.13 à 3.15 sont facultatives pour d’autres essais de séquençage à haut débit.
13. Calculez les quantités d’ADN et d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre basé sur la fluorescence.
    REMARQUE : Le rapport des quantités d’ARN (concentration à base d’UV (ng/μL)/concentration à base de fluorescence (ng/μL)) a été calculé pour évaluer la qualité en vue d’une application expérimentale ultérieure. Par exemple, lorsque les concentrations d’UV et de fluorescence sont respectivement de 80 ng/uL et de 60 ng/uL, le rapport sera de 1,5 (80/60). Habituellement, les rapports inférieurs à 1,5 indiquent une pureté suffisante pour les applications en aval utilisant le séquençage à haut débit¹³.
14. Analyser la qualité de l’ARN à l’aide de l’électrophorèse^{à micropuce 14}.
15. Utilisez les ARN qualifiés pour préparer la bibliothèque d’ARN à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque d’ARN (voir Tableau des matériaux). Séquencez les bibliothèques à l’aide d’une plate-forme adaptée aux bibliothèques préparées.

Résultats

Mise en place des lignes hôtes et leur maintenance
La viabilité des larves collectées sur le terrain est attribuée différemment à l’emplacement, aux saisons et aux conditions d’élevage sur le terrain (p. ex., 90 % de la viabilité à Taïwan, Taoyuan, comme le montrent Arai et ^al.12). Environ 30% à 50% des paires généreront la prochaine génération comme d’habitude. Pour H. magnanima et A. honmai, les matrilines sont maintenues par consanguini...

Discussion

Tortricid comprend plusieurs ravageurs agricoles et forestiers; la présente étude a présenté des méthodes pour élever la tortrix au fil des générations, observer l’embryogenèse et le sexe des insectes, et effectuer une analyse moléculaire à l’aide d’embryons matures.

L’un des obstacles à l’étude des insectes nuisibles est d’établir des méthodes d’élevage. En particulier, la consanguinité affecte parfois négativement la condition physique de l’espèce. La rédu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 ounce cup	FP CHUPA	CP070009	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lid	FP CHUPA	CP070011	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	36289	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kit	Agilent Technologies	5067-1511	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf
benzalkonium chloride solution	Nihon Pharmaceutical Co., Ltd	No.4987123116046	Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
Cotton	AOUME	8-1611-02	insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
DAPI solution	Dojindo, Tokyo, Japan	340-07971	stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Disodium Hydrogenphosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
dsDNA HS quantification kit	Invitrogen	Q33231	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Econospin RNA II column	Epoch Life Science Inc.	EP-11201	RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
Ethanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA)	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Glassine paper	HEIKO	2100010	insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCK	ATTO, Tokyo, Japan	4002620	incubation; https://www.attoeng.site/
heptane	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LF	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
ISOGENII	Nippon Gene	311-07361	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
isopropanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Lactic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
methanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 vortex	Biosan	BS-010210-TAK	Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80	Implen	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wide	Inomata chemical	1859	insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7770S	Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orcein	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
Paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	160-16061	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength)	Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan	not shown	Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen Phosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen, MA, USA	P36965	antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K Solution	Merck	71049-4CN	DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solution	Qiagen	158912	DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4	Invitrogen	Q33238	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicin	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kit	Invitrogen	Q32855	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solution	Nippon Gene	313-01461	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2S	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water	Invitrogen	10977023	RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015