Immunoétiquetage et comptage des synapses rubanées chez les cochlées de gerbille jeunes adultes et âgées

Résumé

Un protocole pour le traitement des cochlées de gerbilles jeunes adultes et âgées par immunomarquage des structures synaptiques afférentes et des cellules ciliées, extinction de l’autofluorescence dans les tissus âgés, dissection et estimation de la longueur des cochlées et quantification des synapses dans des piles d’images obtenues par imagerie confocale est présenté.

Résumé

La perte de synapses ruban reliant les cellules ciliées internes et les fibres nerveuses auditives afférentes est supposée être l’une des causes de la perte auditive liée à l’âge. La méthode la plus courante pour détecter la perte de synapses rubanées est l’immunomarquage, car elle permet un échantillonnage quantitatif à partir de plusieurs emplacements tonotopiques dans une cochlée individuelle. Cependant, les structures d’intérêt sont enfouies profondément à l’intérieur de la cochlée osseuse. Les gerbilles sont utilisées comme modèle animal pour la perte auditive liée à l’âge. Ici, les protocoles de routine pour la fixation, l’immunomarquage des montures entières cochléaires de gerbille, l’imagerie confocale et la quantification du nombre et des volumes de synapses du ruban sont décrits. En outre, les défis particuliers associés à l’obtention de bons matériaux auprès de personnes vieillissantes précieuses sont mis en évidence.

Les gerbilles sont euthanasiées et perfusées cardiovasculairement, ou leurs bulles tympaniques sont soigneusement disséquées hors du crâne. Les cochlées sont ouvertes à l’apex et à la base et directement transférées au fixateur. Quelle que soit la méthode initiale, les cochlées sont postfixées puis décalcifiées. Le tissu est ensuite marqué avec des anticorps primaires contre les structures pré- et postsynaptiques et les cellules ciliées. Ensuite, les cochlées sont incubées avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence qui sont spécifiques contre leurs anticorps primaires respectifs. Les cochlées des gerbilles âgées sont ensuite traitées avec un quencher à autofluorescence pour réduire la fluorescence de fond généralement importante des tissus des animaux plus âgés.

Enfin, les cochlées sont disséquées en 6 à 11 segments. Toute la longueur cochléaire est reconstruite de manière à ce que des emplacements cochléaires spécifiques puissent être déterminés de manière fiable entre les individus. Les piles d’images confocales, acquises séquentiellement, aident à visualiser les cellules ciliées et les synapses aux endroits choisis. Les piles confocales sont déconvolvées et les synapses sont soit comptées manuellement à l’aide d’ImageJ, soit une quantification plus étendue des structures synaptiques est effectuée avec des procédures d’analyse d’images écrites sur mesure dans Matlab.

Introduction

La perte auditive liée à l’âge est l’une des maladies les plus répandues au monde qui touche plus d’un tiers de la population mondiale âgée de 65 ans et plus¹. Les causes sous-jacentes sont encore débattues et activement étudiées, mais peuvent inclure la perte des synapses spécialisées reliant les cellules ciliées internes (IHC) aux fibres nerveuses auditives afférentes². Ces synapses rubanées comprennent une structure présynaptique qui a des vésicules remplies du neurotransmetteur glutamate attaché à elle, ainsi que des récepteurs postsynaptiques α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique acide (AMPA) glutamate

Protocole

Tous les protocoles et procédures ont été approuvés par les autorités compétentes de Basse-Saxe (Allemagne), avec les numéros de permis AZ 33.19-42502-04-15/1828 et 33.19-42502-04-15/1990. Ce protocole s’applique aux gerbilles mongoles (M. unguiculatus) des deux sexes. Jeune adulte se réfère à l’âge de 3-12 mois, tandis que les gerbilles sont considérées comme âgées à 36 mois et plus. Sauf indication contraire, les tampons et les solutions peuvent être préparés et conservés au réfrigérateur jusqu’à plusieurs mois (4-8 °C). Avant utilisation, assurez-vous que les tampons et les solutions n’ont pas précipité.

1. Fixation et pré....

Résultats

Les cochlées ont été soit récoltées après perfusion cardiovasculaire avec fixateur de l’animal entier, soit rapidement disséquées après euthanasie de l’animal et fixées par immersion. Avec cette dernière méthode, les IHC sont restés en place pendant la dissection, alors que, en cas de perfusion infructueuse et donc de tissu insuffisamment fixé, l’épithélium sensoriel était souvent détruit. Notez que les auteurs ont rencontré des cas où la fixation des cochlées après perfusion transcardique ét.......

Discussion

Avec la méthode décrite dans ce protocole, il est possible d’immunomarquer les IHC et les structures synaptiques dans les cochlées des gerbilles jeunes adultes et âgées, d’identifier les synapses fonctionnelles présumées par colocalisation d’éléments pré- et postsynaptiques, de les attribuer à des IHC individuels et de quantifier leur nombre, leur volume et leur emplacement. Les anticorps utilisés dans cette approche ont également marqué les cellules ciliées externes (OHC; myoVIIa) et leurs rubans p.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V biotin-free	Carl Roth	0163.2
anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)	BD Biosciences, Eysins	612044
anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)	Millipore	MAB39
anti-mouse (IgG1)-AF 488	Molecular Probes Inc.	A21121
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)	Proteus Biosciences	25e6790
Blade Holder & Breaker - Flat Jaws	Fine Science Tools	10052-11
Bonn Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm	Carl Roth	LH26.1
Disposable Surgical Blade	Henry Schein	0473
donkey anti-rabbit (IgG)-AF647	Life Technologies-Molecular Probes	A-31573
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol, absolute 99.8%	Fisher Scientific	12468750
Ethylenediaminetetraacetic acid	Carl Roth	8040.2
Excel	Microsoft Corporation
Feather Double Edge Blade	PLANO	112-9
G19 Cannula	Henry Schein	9003633
goat anti-mouse (IgG2a)-AF568	Invitrogen	A-21134
Heparin	Ratiopharm	N68542.04
Huygens Essentials	Scientific Volume Imaging
ImageJ	Fiji
Immersol, Immersion oil 518F	Carl Zeiss	10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)	Braun	4062957E
ISM596D	Ismatec		peristaltic pump
KL 1600 LED	Schott	150.600	light source for stereomicroscope
Leica Application suite X	Leica Microsystem CMS GmbH
Leica TCS SP8 system	Leica Microsystem CMS GmbH
Matlab	The Mathworks Inc.
Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut	Fine Science Tools	14512-17
Mini-100 Orbital-Genie	Scientific Industries	SI-M100	for use in cold environment
Narcoren (pentobarbital)	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-Ei	Nikon
NIS Elements	Nikon Europe B.V.
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3
Petri dish without vents	Avantor VWR	390-1375
Phosphate-buffered saline:
Disodium phosphate	AppliChem	A1046
Monopotassium phosphate	Carl Roth	3904.1
Potassium chloride	Carl Roth	6781.1
Sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-M
Screw Cap Containers	Sarstedt	75.562.300
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
Student Adson Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Student Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	91308-12
Superfrost Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton  X	Carl Roth	3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher	Biotium	23007
Vannas Spring Scissors, 3mm	Fine Science Tools	15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Vibrax VXR basic	IKA	0002819000
VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic	IKA	953300
Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)	Wild Heerbrugg		not available anymore