Préparation de particules de noyau de nucléosomes complexées avec des facteurs de réparation de l’ADN pour la détermination structurelle de la cryo-microscopie électronique

Résumé

Ce protocole décrit en détail la préparation des complexes nucléosomiques à l’aide de deux méthodes de préparation des échantillons pour la congélation des grilles TEM.

Résumé

La réparation de l’ADN dans le contexte de la chromatine est mal comprise. Des études biochimiques utilisant des particules de noyau de nucléosome, l’unité répétitive fondamentale de la chromatine, montrent que la plupart des enzymes de réparation de l’ADN éliminent les dommages à l’ADN à des taux réduits par rapport à l’ADN libre. Les détails moléculaires sur la façon dont les enzymes de réparation par excision de base (BER) reconnaissent et éliminent les dommages à l’ADN dans les nucléosomes n’ont pas été élucidés. Cependant, les données biochimiques BER des substrats nucléosomales suggèrent que le nucléosome présente différentes barrières structurelles en fonction de l’emplacement de la lésion de l’ADN et de l’enzyme. Cela indique que les mécanismes employés par ces enzymes pour éliminer les dommages à l’ADN dans l’ADN libre peuvent être différents de ceux employés dans les nucléosomes. Étant donné que la majorité de l’ADN génomique est assemblée en nucléosomes, des informations structurelles sur ces complexes sont nécessaires. À ce jour, la communauté scientifique ne dispose pas de protocoles détaillés pour réaliser des études structurelles techniquement réalisables de ces complexes. Ici, nous fournissons deux méthodes pour préparer un complexe de deux enzymes BER génétiquement fusionnées (polymérase β et endonucléase AP1) liées à un espace mononucléotidique près de l’entrée-sortie du nucléosome pour la détermination structurelle de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Les deux méthodes de préparation des échantillons sont compatibles pour vitrifier les grilles de qualité par congélation. Ce protocole peut être utilisé comme point de départ pour préparer d’autres complexes nucléosomiques avec différents facteurs BER, facteurs de transcription pionniers et enzymes modifiant la chromatine.

Introduction

L’ADN eucaryote est organisé et compacté par les protéines histones, formant de la chromatine. La particule centrale du nucléosome (NCP) constitue l’unité répétitive fondamentale de la chromatine qui régule l’accessibilité aux protéines de liaison à l’ADN pour la réparation, la transcription et la réplication de l’ADN¹. Bien que la première structure cristalline en rayons X du NCP ait été résolue pour la première fois il y a plus de deux décennies² et que de nombreuses autres structures du NCP aient été publiées depuis 3,4,5,6^,<....

Protocole

1. Assembler les particules du noyau du nucléosome par dialyse sel-gardient

NOTE: La préparation de particules de noyau de nucléosome à l’aide de protéines histones recombinantes pour des études structurales a été décrite en détail par d’autres 14,15,16. Suivre la purification des histones recombinantes de X. laevis et de l’assemblage octomère d’histones décrites par d’autres^14,15, et assembler le substrat nucléosomique comme décrit ci-dessous.

1. Achetez tr....

Résultats

Des NCP correctement assemblés (Figure 2) ont été utilisés pour fabriquer un complexe avec une protéine de fusion recombinante de MBP-Polβ-APE1 (Figure 3). Pour déterminer le rapport NCP / MBP-Polβ-APE1 pour former un complexe stable, nous avons effectué des tests de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) (Figure 4), qui ont montré une bande décalée individuellement du NCP avec un excès molaire 5 fois de M.......

Discussion

Un protocole spécifique pour purifier le facteur de réparation de l’ADN dépendra de l’enzyme d’intérêt. Cependant, il existe certaines recommandations générales, notamment l’utilisation de méthodes recombinantes pour l’expression et la purification des protéines¹⁸; si la protéine d’intérêt est trop petite (<50 kDa), la détermination de la structure par cryo-EM était presque impossible jusqu’à plus récemment grâce à l’utilisation de systèmes de fusion

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES; pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15630080
1 M MgCl2	Thermo Fisher Scientific	AM9530G
10x TBE	Bio-rad	1610733
25% glutaraldehyde	Fisher Scientific	50-262-23
3 M KCl	Thermo Fisher Scientific	043398.K2
491 prep cell	Bio-rad	1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)	Millipore Sigma	Z717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)	Millipore Sigma	UFC8030
AutoGrid Tweezers	Ted Pella	47000-600
Automatic Plunge Freezer	Leica	Leica EM GP
C-1000 touch thermocycler	Bio-rad	1851148
C-clips and rings	Thermo Fisher	6640--6640
Clipping station	SubAngostrom	SCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)	Fisher Scientific	15370752
Diamond Tweezers	Techni-Pro	758TW0010
dsDNA	Integrated DNA techonologies	N/A
FEI Titan Krios	Thermo Fisher	KRIOSG4TEM
FPLC purification system	AKTA Pure	29018224
Fraction collector Model 2110	Bio-rad	7318122
Glow Discharge Cleaning System	Ted Pella	91000S
Grid Boxes	SubAngostrom	PB-E
Grid Storage Accessory Pack	SubAngostrom	GSAX
Liquid Ethane	N/A	N/A
Liquid Nitrogen	N/A	N/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pump	Gilson	F155008
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	EC6695BOX
Pipetman	Gilson	FA10002M
Pipette tips (VWR) Low Retention	VWR	76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1)	Bio-rad	1610158
polyethylene glycol (PEG)	Millipore Sigma	P4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500	Millipore Sigma	PURX35050
Purified recombinant DNA repair factor	N/A	N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids	Quantifoil	N1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamer	N/A	N/A
Spring clipping tools	SubAngostrom	CSA-01
Superdex 200 column 10/300	Millipore Sigma	GE28-9909-44
Transmission Electron Microscope	Thermo Fisher	Talos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I	Ted Pella	47000-500
UltraPure Glycerol	Thermo Fisher Scientific	15514011
Vitrobot	Thermo Fisher	Mark IV System
Whatman Filter paper (55 mM)	Cytiva	1005-055
Xylene cyanol	Thermo Fisher Scientific	440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL	Thermo Fisher Scientific	89877