Acquisition et perfusion-décellularisation de lambeaux vascularisés porcins dans un bioréacteur de perfusion personnalisé

Résumé

Le protocole décrit l’obtention chirurgicale et la décellularisation ultérieure des lambeaux porcins vascularisés par perfusion du détergent au dodécylsulfate de sodium à travers le système vasculaire du lambeau dans un bioréacteur de perfusion personnalisé.

Résumé

Les défauts des tissus mous de grand volume entraînent des déficits fonctionnels et peuvent avoir un impact considérable sur la qualité de vie du patient. Bien que la reconstruction chirurgicale puisse être réalisée par transfert de lambeau libre autologue ou allotransplantation composite vascularisée (AVC), de telles méthodes présentent également des inconvénients. Des problèmes tels que la morbidité sur le site donneur et la disponibilité des tissus limitent le transfert de lambeau libre autologue, tandis que l’immunosuppression est une limitation importante de l’ACV. Les tissus modifiés en chirurgie reconstructive utilisant des méthodes de décellularisation / recellularisation représentent une solution possible. Les tissus décellularisés sont générés à l’aide de méthodes qui éliminent le matériel cellulaire natif tout en préservant la microarchitecture sous-jacente de la matrice extracellulaire (ECM). Ces échafaudages acellulaires peuvent ensuite être recellularisés avec des cellules spécifiques au receveur.

Ce protocole détaille les méthodes d’approvisionnement et de décellularisation utilisées pour réaliser des échafaudages acellulaires dans un modèle porcin. En outre, il fournit également une description de la conception et de la configuration du bioréacteur de perfusion. Les lambeaux comprennent l’épiploon porcin, le fascia lata tenseur et l’avant-bras radial. La décellularisation est réalisée par perfusion ex vivo de détergent à faible concentration de dodécylsulfate de sodium (SDS), suivie d’un traitement enzymatique par la DNase et d’une stérilisation à l’acide peracétique dans un bioréacteur de perfusion personnalisé.

Une décellularisation tissulaire réussie se caractérise par un aspect blanc-opaque des lambeaux macroscopiquement. Les lambeaux acellulaires montrent l’absence de noyaux sur la coloration histologique et une réduction significative de la teneur en ADN. Ce protocole peut être utilisé efficacement pour générer des échafaudages de tissus mous décellularisés avec une ECM préservée et une microarchitecture vasculaire. De tels échafaudages peuvent être utilisés dans des études de recellularisation ultérieures et ont le potentiel d’une traduction clinique en chirurgie reconstructive.

Introduction

Les lésions traumatiques et l’ablation de la tumeur peuvent entraîner des défauts des tissus mous importants et complexes. Ces défauts peuvent nuire à la qualité de vie du patient, entraîner une perte de fonction et entraîner une invalidité permanente. Bien que des techniques telles que le transfert de lambeau de tissu autologue aient été couramment pratiquées, les problèmes liés à la disponibilité du lambeau et à la morbidité au site donneur sont des limites majeures ^1,2,3. L’allotransplantation composite vascularisée (ACV) est une alternative prometteuse qui transfère les t....

Protocole

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (CCIA) du Réseau universitaire de santé et sont effectuées conformément au protocole et aux procédures du Centre de ressources animales du Réseau universitaire de santé et aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Cinq porcs Yorkshire (35-50 kg; âgés d’environ 12 semaines) ont été utilisés pour toutes les expériences.

1. Fabrication de bioréacteurs de perfusion

1. Voir la figure 1 pour tous les composants utilisés dans le bioréacteur de perfusion....

Résultats

Ce protocole de décellularisation des lambeaux porcins vascularisés repose sur la perfusion d’un détergent à base ionique, SDS, à travers le système vasculaire du volet dans un bioréacteur de perfusion personnalisé. Avant la décellularisation, trois lambeaux vascularisés dans un modèle porcin ont été achetés et canulés en fonction de leurs principaux vaisseaux d’alimentation. Les volets ont été immédiatement rincés après l’approvisionnement afin de maintenir un système vasculaire perfusable bre.......

Discussion

Le protocole proposé utilise la perfusion de SDS à faible concentration pour décellulariser une gamme de lambeaux d’origine porcine. Avec cette procédure, l’épiploon acellulaire, le fascia lata tenseur et les lambeaux radiaux de l’avant-bras peuvent être décellularisés avec succès en utilisant un protocole qui favorise les SDS à faible concentration. Des expériences d’optimisation préliminaires ont déterminé que la SDS à une faible concentration (0,05%) entre 2 jours et 5 jours est capable d’éli.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm pore Acrodisk Filter	VWR	CA28143-310
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)	Baxter	JF7123
20 L Polypropylene Carboy	Cole-Parmer	RK-62507-20
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie	Covidien	LS639
3-way Stopcock	Cole-Parmer	UZ-30600-04
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X	Wisent	450-115-EL
Atropine Sulphate 15 mg/30ml	Rafter 8 Products	238481
BD Angiocath 20-Gauge	VWR	BD381134
BD Angiocath 22-Gauge	VWR	BD381123
BD Angiocath 24-Gauge	VWR	BD381112
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901	DNAse Co-factor
DNase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)	Invitrogen	P7589
DPBS, 10X	Wisent	311-415-CL	without Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	13008-12
Heparin, 1000 I.U./mL	Leo Pharma A/S	453811
Ketamine Hydrochloride  5000 mg/50 ml	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	612316
Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing	Cole-Parmer	RK-96450-40	Internal Diameter:  1.85 mm
Ismatec REGLO 4-Channel Pump	Cole-Parmer	78001-78
Ismatec Tubing Cassettes	Cole-Parmer	RK-78016-98
Isoflurane 99.9%, 250 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2231929
LB Agar Lennox	Bioshop Canada	LBL406.500	Sterility testing agar plates
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	DNAse Co-factor
Masterflex L/S 16 Tubing	Cole-Parmer	RK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2242905
Monopolar Cautery Pencil	Valleylab	E2100
Normal Buffered Formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
N°11 scalpel blade	Swann Morton	303
Papain from papaya latex	Sigma-Aldrich	P3125
Peracetic Acid	Sigma-Aldrich	269336
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID	McMaster-Carr	5117K61
Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors	McMaster-Carr	5117K76
Plastic Quick-Turn Tube Plugs	McMaster-Carr	51525K143	Male Luer
Plastic Quick-Turn Tube Sockets	McMaster-Carr	51525K293	Female Luer
Punch Biopsy Tool	Integra Miltex	3332
Potassium Chloride 40 mEq/20 ml	Hospira Healthcare Corporation	37869
Povidone-Iodine, 10%	Rougier	833133
Serological Pipet, 2mL	Fisher Science	13-678-27D
Snap Lid Airtight Containers	SnapLock	142-3941-4
Sodium Dodecyl Sulfate Powder	Sigma-Aldrich	L4509
Surgical Metal Ligation Clips, Small	Teleflex	001200
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight	B. Braun	BC004R
TruWave Pressure Monitoring Set	Edwards Lifesciences	PX260