Greffe de semis évolutive, flexible et rentable

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de greffe de plantules robuste qui ne nécessite aucune expérience ou formation préalable et peut être exécutée à très faible coût en utilisant des matériaux facilement accessibles dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire.

Résumé

La greffe de semis à un stade précoce est devenue un outil populaire en génétique moléculaire pour étudier les relations racine-pousse au sein des plantes. La greffe de semis à un stade précoce de la petite plante modèle, Arabidopsis thaliana, est techniquement difficile et prend beaucoup de temps en raison de la taille et de la fragilité de ses semis. Une collection croissante de méthodes publiées décrivent cette technique avec des taux de réussite, des difficultés et des coûts associés variables. Cet article décrit une procédure simple pour fabriquer un dispositif de greffage réutilisable interne à l’aide d’un mélange d’élastomère de silicone, et comment utiliser ce dispositif pour la greffe de semis. Au moment de la présente publication, la production de chaque dispositif de greffe réutilisable ne coûte que 0,47 $ en matériaux consommables. En utilisant cette méthode, les débutants peuvent avoir leurs premiers plants greffés avec succès en moins de 3 semaines du début à la fin. Cette procédure hautement accessible permettra aux laboratoires de génétique moléculaire des plantes d’établir la greffe de semis comme une partie normale de leur processus expérimental. En raison du contrôle total que les utilisateurs ont dans la création et la conception de ces dispositifs de greffe, cette technique pourrait être facilement ajustée pour une utilisation dans des plantes plus grandes, telles que la tomate ou le tabac, si désiré.

Introduction

Le greffage est une technique horticole ancienne qui est devenue une pratique agricole établie en 500 avant notre ère¹. La greffe de différentes variétés de plantes cultivées pour améliorer les rendements a été la première utilisation de cette technique et continue d’être utilisée à cette fin aujourd’hui. Au cours de la dernière décennie, la greffe a attiré de plus en plus l’attention en tant qu’outil permettant aux biologistes moléculaires d’étudier la signalisation à longue distance chez les plantes 2,3,4,5. Bien que la greffe de plantes adultes soit relativement facile, il est difficile de greffer des plantes peu de temps après la germination. Malgré cela, il est parfois nécessaire d’évaluer les effets de la signalisation à longue distance dans des processus tels que le développement des plantes, les réponses environnementales et la floraison ^6,7,8.

Arabidopsis thaliana a été établi comme l’organisme modèle en biologie végétale pour de nombreuses raisons, y compris sa taille relativement petite, ce qui le rend facile à cultiver à l’intérieur d’un laboratoire. Cependant, la petite taille et la fragilité des plants d’Arabidopsis rendent la greffe de jeunes plants très difficile. Dans de nombreux cas, une formation pratique approfondie est nécessaire pour réussir à obtenir des greffes de semis. Il y a eu de nombreuses améliorations méthodologiques au fil des ans qui ont permis d’identifier des conditions de croissance idéales et de nouvelles techniques pour augmenter le taux de réussite de la greffe de semis 9,10,11. L’outil le plus récent introduit était une puce de greffe de plantules Arabidopsis, qui permet même aux utilisateurs inexpérimentés d’atteindre des niveaux acceptables de réussite de greffe¹². Bien que cette avancée ait considérablement abaissé la barrière technique de la greffe de semis, le dispositif de puce est coûteux et le nombre de greffes pouvant être effectuées en parallèle devient rapidement prohibitif.

De plus, cet appareil ne peut être utilisé que pour les plantules d’Arabidopsis qui ont des dimensions hypocotyles similaires à celles des plantules de type sauvage. Bien qu’Arabidopsis soit l’espèce clé dans le monde de la génétique moléculaire des plantes, des travaux récents ont été effectués sur d’autres espèces en utilisant la greffe de semis. Les exemples incluent la greffe de soja et de haricot commun, le tabac à la tomate et le canola à Arabidopsis, puis l’échantillonnage des deux tissus pour les petits ARN^13,14. Par conséquent, une méthode de greffage accessible à la plupart des laboratoires et pouvant être facilement adaptée à un large éventail d’espèces végétales sans modification majeure de la technique est hautement souhaitable.

Ce protocole détaille une méthode qui utilise la production interne d’un dispositif de greffage simple qui permet la personnalisation complète du diamètre et de la longueur du canal de greffage pour s’adapter à toute morphologie de semis chez la plupart des espèces végétales. La production de ces appareils est très abordable et hautement évolutive, car les seuls composants nécessaires sont un élastomère de silicone, un câblage ou un tube de la bonne taille, une lame de haute précision et un récipient pour servir de moule. En suivant le protocole de greffe détaillé ici, les utilisateurs peuvent obtenir des taux de greffe réussis de 45% (n = 105), comparables aux résultats de greffe précédemment rapportés^10,12.

Protocole

1. Préparation de l’appareil

1. Fabriquer le dispositif de greffe de silicone en coulant une solution d’élastomère de silicone dans une boîte de Petri carrée (100 mm x 100 mm). Préparer 15 mL de la solution élastomère en suivant les directives du fabricant.
   REMARQUE: Les kits d’élastomère de silicone comprennent généralement un liquide à base de silicone et un agent de durcissement qui, lorsqu’ils sont mélangés, permettent au silicone de se solidifier.
2. Préparez la boîte de Petri carrée en déposant quatre morceaux droits de fil de 29 G dans la boîte de Petri carrée, équidistants les uns des autres (Figure 1A). Assurez-vous que le fil affleure le fond du moule. Pour redresser complètement le fil, roulez-le sur une surface dure et uniforme avec un objet lourd et plat (par exemple, un support de tubes métalliques).
   REMARQUE: Les attaches torsadées contiennent souvent un fil de 29 G et peuvent être utilisées après avoir retiré le revêtement extérieur de papier avec de l’acétone.
3. Versez la solution d’élastomère de silicone mélangée sur les fils et couvrez avec le dessus de la boîte de Pétri. Laisser durcir le silicone pendant 24-48 h à température ambiante.
4. Retirez la feuille de silicone de la boîte de Petri à l’aide d’une pince propre et déplacez-la sur une surface plane et propre.
5. Retirez les fils de la feuille de silicone. Retirez la fine couche de silicone restant à l’extérieur du canal à l’aide d’une pince à pointe fine, pour permettre au canal d’être ouvert d’un côté (Figure 1A).
6. Couper la feuille de silicone perpendiculairement aux canaux en bandes de 3 mm à l’aide de ciseaux propres. Déplacez chaque bande dans une enveloppe en papier d’aluminium et scellez-la avec du ruban autoclave.
7. Autoclaver les bandes à 121 °C pendant au moins 30 min et conserver jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.

2. Préparation des plantules

1. Stériliser et vernaliser les graines.
   1. Suspendre jusqu’à 100 graines d’Arabidopsis dans 1 mL de solution d’eau de Javel à 50 % contenant 0,1 % de Tween 20 dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et incuber pendant 5 à 10 minutes. Retirer la solution d’eau de Javel par pipetage ou aspiration dans des conditions stériles. Rincer les graines avec 1 mL de dH₂O stérilisé. Assurez-vous d’inverser les tubes pour rincer adéquatement les graines et retirez toute solution d’eau de Javel laissée au sommet du tube. Répétez le rinçage 4x.
   2. Laisser environ 0,25 mL d’eau dans les tubes avec les graines et conserver à 4 °C pendant 3 jours dans l’obscurité.
2. Plaquer les graines en préparation pour la greffe.
   1. Préparer une plaque de gélose MS à 1 % comme suit : pour 1 L de milieu solide MS (0,5 % saccharose), mélanger 4,4 g de sel MS, 5 g de saccharose et 10 g de gélose dans 800 mL d’eau, ajuster le pH à 5,7 avec KOH, puis porter le volume total à 1 L avec de l’eau supplémentaire. Autoclave pendant au moins 20, min avant de verser ~25 ml dans les boîtes de Petri carrées.
   2. Dans des conditions stériles, déplacer le nombre approprié de graines préparées dans l’assiette, à l’aide d’un embout de pipette de 20 μL pour aspirer et transférer les graines.
   3. Placez une bande stérile sur la surface de la plaque pour guider le positionnement des graines, de sorte que les graines soient alignées avec les canaux sur la bande. Retirez la bande une fois les graines plaquées.
      REMARQUE : Une plaque carrée de 100 mm x 100 mm peut accueillir deux rangées de semis (figure 1B).
   4. Une fois que les plaques sont debout, laissez le liquide s’évaporer du milieu solide et accumulez au fond de la plaque. Une fois les graines placées sur l’assiette, placez sur le couvercle de la plaque et scellez un côté de la plaque parallèle aux deux rangées de graines (indiquées par la région surlignée en bleu à la figure 1B) avec un parafilm. Enroulez du ruban adhésif respirant sur le dessus du parafilm et autour de tous les autres bords de la plaque.
3. Dressez soigneusement deux plaques avec le côté scellé au parafilm vers le bas. Séparez les deux plaques au fond en plaçant un tube centrifuge horizontal de 15 mL entre elles et fixez-les à l’aide d’un élastique. Assurez-vous que les surfaces de la plaque forment un angle de 100°-110° avec la surface de paillasse (Figure 1C).
4. Conserver les plaques dans cette orientation pendant 72 h dans l’obscurité totale à 21 °C, pour permettre aux hypocotyles de la plantule de croître ~5 mm de longueur. Après 72 h, retirez les plaques de l’obscurité et poussez sous 16 h de lumière (intensité de 100 μE m-2 sec-1) et 8 h de cycles d’obscurité pendant ^2-4 jours de plus à la même température avant la greffe.
5. Greffez les plants entre 5 et 7 jours après avoir été plaqués. Placez une bande de greffe sur les plantules en insérant leurs hypocotyles dans les canaux. Positionner doucement le semis de manière à ce que la jonction racine-hypocotyle soit positionnée au bas de la bande de silicone pour préparer le semis à la coupe (figure 1D).

3. Procédure de greffe

1. Préparez un environnement de travail stérile en désinfectant une lunette de dissection avec de l’éthanol à 70 % et en autoclavant deux paires de pinces à pointe fine et un manche de scalpel. Effectuer toutes les procédures de greffe dans une goulotte stérile et à l’aide d’une lunette de dissection au besoin. Effectuez la majeure partie de la greffe en utilisant un grossissement de 10,5x.
2. Préparez les scions. Utilisez une lame de scalpel fraîche pour couper l’hypocotyle perpendiculairement afin de créer une coupe droite et nette. Poussez la lame vers l’avant plutôt que d’appuyer vers le bas dans la plante pour éviter que le semis ne soit poussé dans la gélose (vidéo 1).
3. Retirez la pousse. Prenez soin de garder la partie coupée de la pousse hydratée en assurant le contact avec la surface du support. Vous pouvez également déplacer la pousse dans une zone d’attente désignée, telle que le dessus d’une boîte de Petri remplie de dH₂O stérile, jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.
4. Préparez les porte-greffes. Tirez doucement la racine en attrapant la racine dans l’espace laissé entre les pinces fermées et en les tournant, en laissant la section coupée des porte-greffes au milieu de la bande (vidéo 2).
   REMARQUE: La racine fragile sera endommagée si elle est écrasée directement entre les pinces fermées, ce qui nécessite de coincer la racine dans l’angle aigu des extrémités de la pince à épiler pour manipuler le tissu.
5. Prenez doucement la pousse désirée à l’aide de la pince à pointe fine et insérez-la dans le haut du canal.
   REMARQUE : Il est essentiel de confirmer visuellement le contact entre les greffons et les porte-greffes pour obtenir une greffe réussie (vidéo 3).
6. Une fois que toutes les greffes ont été faites, enveloppez les plaques avec du parafilm et du ruban respirant et installez les plaques de la même manière qu’auparavant, sans déranger les plants ou les bandes de silicone. Déplacez délicatement les plaques dans une chambre de croissance réglée à 26 °C avec 16 h de cycles de lumière/8 h d’obscurité.
7. Évaluer les plants greffés dans des conditions stériles après 7 à 10 jours. Retirez délicatement la bande de silicone à l’aide d’une pince en décollant un côté, ce qui permet aux canaux de libérer les semis. Enlevez toutes les racines adventives qui poussent à partir du greffon en les coupant du greffon avec une lame de scalpel fraîche ou en les écrasant à l’aide d’une pince à pointe fine. Évaluez visuellement si le porte-greffe s’est solidement attaché au greffon pour former un greffon réussi (Figure 2).
8. Déplacer les greffons réussis vers le sol de multiplication des semis pour qu’ils poussent aussi longtemps que nécessaire. Couvrez le sol avec du plastique transparent pendant quelques jours pendant que les semis s’établissent. Après avoir transféré les plantes dans le sol, cultivez sous les cycles de lumière et d’obscurité mentionnés précédemment à 21 ° C.

Résultats

Divers aspects de la conception de la bandelette de greffe ont été testés afin d’identifier les conditions de greffe optimales qui nécessitaient le moins de compétences techniques (tableau 1). Tous les essais de greffe ont été réalisés sur un milieu de SEP à 0,5 %, qui a déjà été signalé comme un milieu de greffe idéal^11,12.

La croissance optimale des plantules ne peut pas être obtenue avec l...

Discussion

Résumé et importance
La formation d’une union de greffe est cruciale pour une greffe réussie, qui nécessite un contact direct et non perturbé entre le porte-greffe et le greffon. La taille miniature et la fragilité des semis de petites plantes telles qu’Arabidopsis rendent techniquement difficile de répondre à cette exigence. Une technique développée dans les premières méthodes de greffe de plantules d’Arabidopsis consistait à insérer à la fois le greffon et le p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR International Inc	10026-076
ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L	VWR	BJAH010-4
BactoAgar	Sigma	A1296-500g
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit	Dow	2646340
D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg	Fisher Scientific	BP220-1
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500	Fisher Scientific	20901-551 / 05-402
Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-164
Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-111
Fisherbrand square petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711A
Leica Zoom 2000 Stereo Microscope	Microscope Central	L-Z2000
Micropore Tape	3M	B0082A9FEM
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519-10L
Parafilm	Genesee Scientific	16-101
potassium hydroxide	VWR International Inc	AA13451-36
Redi-earth Plug and Seedling Mix	Sun Gro Horticulture	SUN239274728CFLP
Scotts Osmocote Plus	Hummert International	7630600
Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade	Fisher Scientific	22-079-697
Tween 20, 500 mL	Fisher Scientific	BP337500
TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM	VWR	102091-580