Génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de cellules souches pluripotentes

Résumé

Ce protocole décrit la génération de vaisseaux sanguins auto-organisés à partir de cellules souches pluripotentes et pluripotentes induites humaines. Ces réseaux de vaisseaux sanguins présentent un réseau endothélial étendu et connecté entouré de péricytes, d’actine musculaire lisse et d’une membrane basale continue.

Résumé

Un organoïde est défini comme un tissu multicellulaire in vitro modifié qui imite son organe in vivo correspondant de sorte qu’il peut être utilisé pour étudier des aspects définis de cet organe dans une boîte de culture tissulaire. L’étendue et l’application de la recherche sur les organoïdes dérivés des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) ont considérablement progressé pour inclure le cerveau, la rétine, les canaux lacrymaux, le cœur, les poumons, l’intestin, le pancréas, les reins et les vaisseaux sanguins, parmi plusieurs autres tissus. Le développement de méthodes pour la génération de microvaisseaux humains, en particulier, a ouvert la voie à la modélisation in vitro du développement des vaisseaux sanguins humains et de la maladie et à l’essai et à l’analyse de nouveaux médicaments ou tropisme tissulaire dans les infections virales, y compris le SRAS-CoV-2. Des protocoles complexes et longs dépourvus de guidage visuel entravent la reproductibilité de nombreux organoïdes dérivés de cellules souches. De plus, la stochasticité inhérente aux processus de formation organoïde et à l’auto-organisation nécessite la génération de protocoles optiques pour faire progresser la compréhension de l’acquisition et de la programmation du devenir cellulaire. Ici, un protocole guidé visuellement est présenté pour la génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains (BVO) 3D conçus à partir de CSPh. Présentant une membrane basale continue, des cellules endothéliales vasculaires et une articulation organisée avec des cellules murales, les BVO présentent les caractéristiques fonctionnelles, morphologiques et moléculaires de la microvascularisation humaine. La formation de BVO est initiée par la formation d’agrégats, suivie d’une induction du mésoderme et vasculaire. La maturation vasculaire et la formation de réseaux sont initiées et soutenues par l’incorporation d’agrégats dans une matrice de collagène 3D et de membrane basale solubilisée. Les réseaux de vaisseaux humains se forment en 2-3 semaines et peuvent être développés dans des systèmes de culture évolutifs. Il est important de noter que les BVO transplantés chez des souris immunodéprimées s’anastomose avec la circulation endogène de la souris et se spécifient dans les artères fonctionnelles, les veines et les artérioles. Le présent protocole guidé visuellement fera progresser la recherche sur les organoïdes humains, en particulier en ce qui concerne les vaisseaux sanguins en développement normal, la vascularisation tissulaire et la maladie.

Introduction

Le dysfonctionnement vasculaire et les maladies des vaisseaux sanguins présentent des complications marquées dans les fonctions des organes. Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans le monde¹ et sont également le principal facteur contribuant à l’augmentation des coûts des soins de santé aux États-Unis. Le nombre de cas de MCV augmente chaque année, et un nombre croissant de ces cas survient dans des groupes d’âge plus jeunes (20 à 45 ans)². Plusieurs modèles in vivo ont été développés pour explorer le développement et la maturation des vaisseaux sanguins, les maladies vasculaires et le dysfonctionnement endothélial ^3,4. Actuellement, les méthodes combinant des cellules définies par une ou plusieurs lignées dérivées de cellules souches ou isolées de tissus adultes in vivo peuvent créer des réseaux vasculaires qui reproduisent des aspects de la fonction vasculaire humaine et de l’anatomie ^5,6. Les vaisseaux sanguins sont apparus comme l’un des premiers systèmes fonctionnels du mésoderme au cours du développement, et ils s’organisent soit par un processus d’assemblage appelé « vasculogenèse », soit par expansion et ramification à partir de vaisseaux préexistants, appelé « angiogenèse »⁷.

Tirant parti de la puissance de la biologie du développement et de l’assemblage autodirigé, Wimmer et al. ont rapporté les premiers organoïdes 3D auto-organisés de vaisseaux sanguins humains à partir de CSPh qui présentent les caractéristiques fonctionnelles, morphologiques et moléculaires de la microvascularisation humaine⁸. Semblables au système vasculaire humain⁹, ces hBVO sont générés et présents avec un endothélium, une membrane basale continue et des cellules murales environnantes ^8,10. Les hBVO peuvent être transplantés in vivo et anastomosés avec la circulation endogène. Ils peuvent également subir une maturation in vitro et servir de modèles pour les maladies cardiovasculaires (c.-à-d. le diabète)⁸ ou le tropisme tissulaire dans les infections virales telles que le SRAS-CoV-2¹¹. Bien que nous ayons déjà publié un protocole écrit¹⁰, il n’existe aucun protocole vidéo disponible pour cette technique autrement complexe.

Grâce à une progression progressive concise, la formation d’hBVO est réalisée par formation agrégée, induction du mésoderme à l’aide d’un agoniste WNT, Chiron (CHIR99021) et protéine morphogénique osseuse - 4 (BMP4)12,13, induction vasculaire via le facteur de croissance endothéliale vasculaire A (VEGFA) et la forskoline (Fors)12, et intégration dans une matrice de germination personnalisée ^8,10. La maturation vasculaire et la formation du réseau suivent l’incorporation des agrégats dans la matrice de germination. Ces réseaux de vaisseaux humains se forment en 2-3 semaines et peuvent être retirés de la matrice de germination et cultivés dans des systèmes de culture évolutifs jusqu’à 6 mois. Ici, des procédures optiquement guidées sont fournies pour la formation et l’application du système vasculaire dérivé de cellules souches humaines.

Protocole

Toutes les expériences réalisées ici ont utilisé la gamme iPSC humaine H9 disponible dans le commerce. Des lignées de cellules souches pluripotentes humaines (c.-à-d. H9, NC8) couramment disponibles dans le commerce (c.-à-d. H9, NC8) ont également été testées et se sont révélées efficaces pour la génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à l’aide de ce protocole. Pour plus de détails, veuillez vous référer à nos rapports^{publiés précédemment 8,10}.

1. Milieu et formulation de réactifs pour la génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains

1. Préparer le milieu d’agrégation.
   1. Mélanger 40 mL de DMEM/F12 knock-out (milieu à faible osmolalité sans tampon L-glutamine ou HEPES optimisé pour la croissance de l’ESC humain et des CSPi), 10 mL de substitut de sérum knock-out (KOSR), 0,5 mL de 200 mM de dipeptide de L-alanyl-L-glutamine dans 0,85 % de NaCl, 0,5 mL d’acides aminés non essentiels (NEAA), 35 μL de bêta-mercaptoéthanol (BME, 100 μL de 2-mercaptoéthanol dans 10 mL de PBS stérile), et Y-27632 (inhibiteur sélectif et perméable aux cellules de la protéine kinase [ROCK] [10 mM] associée à Rho, bobine enroulée [ROCK]^{14 [10} mM] à 1:200) (voir le tableau des matériaux).
2. Préparer N2B27 (milieu de base supplémenté en N2 et B27).
   1. Mélanger 25 mL de DMEM/F12, 25 mL de milieu neurobasal, 1 mL de supplément de B27, 0,5 mL de supplément de N2, 250 μL de 200 mM de dipeptide L-alanyl-L-glutamine dans 0,85 % de NaCl et 35 μL de bêta-mercaptoéthanol (voir le tableau des matières).
3. Préparer le milieu d’induction du mésoderme.
   1. Compléter le milieu N2B27 avec ChiR (12 μM, inhibiteur de GSK3a/b stimulant l’induction du mésoderme) et BMP-4 (30 ng/mL, activateur MSX2 induisant la lignée mésodermique).
      REMARQUE : Stock (ChiR) : 10 mM (utiliser 1:833, ou 1,2 μL/mL N2B27). Stock (BMP-4) : 100 μg/mL (utiliser 1:3333, ou 0,3 μL/mL N2B27) (voir le tableau des matières).
4. Préparer le milieu d’induction vasculaire.
   1. Compléter le milieu N2B27 avec du VEGFA (100 ng/mL) et de la forskoline (2 μM) (voir le tableau des matières).
5. Préparez la matrice extracellulaire (ECM).
   1. Utilisez 1 mL d’ECM pour un puits d’une plaque de 12 puits (pour l’incorporation de 30 à 50 agrégats). Sur 1 mL de solution ECM utilisée pour chaque puits, utilisez 0,5 mL pour créer une couche inférieure, la « couche 1 », qui servira de base ECM, et 0,5 mL plus les agrégats pour la couche supérieure, la « couche 2 ». L’utilisation de cette approche fournit, grâce à la suspension ECM, suffisamment d’espace et de soutien pour que les réseaux de vaisseaux sanguins humains puissent germer dans toutes les directions.
      REMARQUE : Dans l’ensemble, 1 mL d’ECM contient 500 μL de collagène bovin purifié de type I, 250 μL de matrice membranaire basale solubilisée sécrétée par les cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (voir le tableau des matériaux) et 250 μL de solution matricielle basique (étape 1.5.2). Préparez-le frais et conservez-le sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé.
   2. Pour préparer la solution matricielle de base pour quatre plaques de 12 puits (48 puits), mélanger 5,627 mL de NaOH 0,1 N, 2,498 mL de DMEM 10x, 473 μL de HEPES, 368 μL de bicarbonate de sodium à 7,5 %, 233 μL de 200 mM de dipeptide de L-alanyl-L-glutamine dans 0,85 % de NaCl et 3,451 mL de F-12 de Ham (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Les restes de la solution matricielle de base peuvent être placés dans un tube conique en polypropylène haute clarté de 50 ml coiffé et conservés à 4 °C pour une utilisation pouvant aller jusqu’à 2 mois.
6. Préparez le milieu de germination.
   1. Formuler spécifiquement 50 mL de milieu flexible sans sérum (SFM) pour soutenir le développement des cellules hématopoïétiques humaines, une partie aliquote de 1,3 mL du supplément nutritionnel de milieu sans sérum flexible, 15 % de sérum bovin fœtal (FBS), 250 μL de pénicilline-streptomycine, 500 μL de 200 mM de dipeptide L-alanyl-L-glutamine dans 0,85 % de NaCl, VEGFA (100 ng/mL) et FGF2 (100 ng/mL) (voir le tableau des matières).
7. Préparez la mémoire tampon de blocage.
   1. Mélanger 0,5 g d’albumine sérique bovine, 1,5 mL de sérum fœtal bovin, 250 μL de Tween 20, 250 μL de Triton X-100, 500 μL de désoxycholate de sodium (1 % en poids/vol de stock) et 47,5 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (voir le tableau des matières). Pipeter de haut en bas jusqu’à ce que tous les composants soient bien incorporés et que la solution soit claire.

2. Entretien et culture de cellules souches pluripotentes humaines et pluripotentes induites

1. Effectuer une culture cellulaire à l’aide de plaques de culture tissulaire à 6 puits recouvertes de matrice basale à facteur de croissance réduit LDEV (dilution 1:50) avec milieu de culture de cellules souches (voir le tableau des matériaux).
2. Une fois que les cellules atteignent ~70% de confluence, faites-les passer en utilisant 1 mL d’enzyme dissociant les cellules de mammifères (voir le tableau des matériaux) pendant 3-4 minutes à 37 °C.
   REMARQUE: La division des cellules dans un rapport de 1:6 améliore la viabilité cellulaire et atteint la confluence dans les 2-4 jours pour la plupart des lignées de cellules souches humaines. Pour augmenter la viabilité cellulaire, le milieu de culture complété par l’inhibiteur de ROCK Y-27632 (10 mM, 1:1 000) est utilisé pendant 24 heures après le passage.
3. Changez le milieu de culture quotidiennement jusqu’à ce qu’une confluence de 70% soit atteinte.
   NOTE: Pour la présente étude, à 70% de confluence, un puits d’une plaque de culture cellulaire à 6 puits contient environ 1 million de hPSC H9.

3. Jour 0 - Génération d’agrégats pluripotents à partir d’une suspension unicellulaire

REMARQUE : Une confluence de 70 % dans deux puits d’une plaque de culture à 6 puits donnera environ 175 hBVO.

1. À l’aide d’une pipette ou d’un système à vide, aspirer le milieu de culture, le remplacer par 1 mL de réactif de dissociation cellulaire (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 5 minutes à 37 °C.
2. Pendant que les cellules sont sous le réactif de dissociation cellulaire, préparer le volume nécessaire de milieu d’agrégation (étape 1.1) dans un tube conique de 15 mL au besoin pour le nombre désiré de puits dans une plaque de culture à 6 puits à très faible attachement (voir le tableau des matériaux).
3. Aspirer 1 mL de réactif de dissociation cellulaire et suspendre les cellules dans 1 mL de milieu d’agrégation. Créez une suspension unicellulaire avec un pipetage doux de haut en bas avant de compter les échantillons.
   ATTENTION : les CSPh sont très sensibles aux contraintes mécaniques et ne peuvent tolérer un pipetage agressif.
4. Comptez les cellules à l’aide d’un dispositif automatisé de comptage^{de cellules 10} ou d’un système normalisé au microscope. Calculez le numéro de cellule nécessaire pour l’expérience.
   REMARQUE : Selon la lignée cellulaire, 200 000 cellules/puits à 300 000 cellules/puits sont considérées comme idéales pour la formation d’agrégats (c.-à-d. 4 puits = 800 000 à 1 200 000 cellules au total).
5. Ajouter le volume approprié de la suspension cellulaire au milieu d’agrégation dans le tube conique en polypropylène haute clarté de 15 mL. Pipeter doucement la suspension cellulaire diluée de haut en bas pour assurer une distribution homogène des cellules.
6. Pipeter 3 mL de la suspension cellulaire diluée dans chaque puits désiré de la plaque de culture à 6 puits à très faible attache.
7. Placez la plaque dans l’incubateur (37 °C, 5% CO₂, >90% d’humidité) et évitez autant que possible d’ouvrir et de fermer les portes de l’incubateur.
   REMARQUE: Cette étape initiale est mieux effectuée le soir ou pendant un faible achalandage de l’incubateur. Même de légères vibrations peuvent affecter la taille et la forme des agrégats, ce qui peut nuire aux résultats.

4. Jour 1 - Induction d’agrégats par le mésoderme

1. Assurez-vous que 24 heures après l’ensemencement, de petits agrégats comprenant 2 à 10 cellules sont visibles au microscope. Recueillir les agrégats et les laisser se déposer avant de changer le milieu pour le milieu d’induction du mésoderme (étape 1.3).
2. Installez un tube conique en polypropylène haute clarté de 15 ml par puits de la plaque de culture à très faible fixation à 6 puits.
3. Utilisez un mouvement circulaire (c.-à-d. comme un agitateur orbital) pour rassembler les agrégats au centre de chaque puits, utilisez une pipette de 1 mL pour recueillir doucement les agrégats et le milieu environnant de chaque puits, placez-les dans leurs tubes coniques en polypropylène haute clarté correspondants de 15 mL et laissez les agrégats sédimenter à température ambiante.
4. Une fois recueilli, réglez une minuterie sur 1 h, ce qui est le temps nécessaire à la plupart des lignées cellulaires / agrégats pour sédimenter à ce stade.
   REMARQUE : Si le temps est inférieur à 1 h, on peut perdre tous les agrégats qui ne se sont peut-être pas déposés au fond du tube conique de 15 mL.
5. Une fois l’heure écoulée, aspirez avec prudence le surnageant avec une pipette ou une pompe d’aspiration à haute sensibilité. Assurez-vous que les agrégats ne sont pas perturbés au fond du tube conique de 15 mL.
6. Resuspendre les agrégats de chaque tube conique de 15 mL dans 2 mL de milieu d’induction mésoderme et les replacer dans leurs puits respectifs de la plaque de culture à 6 puits à très faible attache.
7. Replacez la plaque dans l’incubateur (37 °C) et laissez-la jusqu’au jour 4.
   REMARQUE : Si les agrégats se fixent et se développent les uns sur les autres, à l’aide d’une pipette de 1 mL, pipeter doucement chaque puits d’agrégats de haut en bas une fois par jour pour garder les agrégats de taille similaire.

5. Jour 4 - Induction vasculaire et amorçage des agrégats

1. Recueillir les agrégats et les laisser se déposer avant de changer le milieu pour le milieu d’induction vasculaire (étape 1.4).
2. Mettre en place un tube conique de 15 ml par puits de la plaque de culture à 6 puits à très faible attache.
3. Utilisez un mouvement circulaire (c.-à-d. comme un agitateur orbital) pour rassembler les agrégats au centre de chaque puits, utilisez une pipette de 1 mL pour recueillir doucement les agrégats et le milieu environnant de chaque puits, et placez-les dans leurs tubes coniques correspondants de 15 mL.
4. Une fois recueillis, réglez une minuterie sur 30 minutes pour permettre aux agrégats de sédimenter.
   REMARQUE: Un temps de 30 minutes est nécessaire pour la plupart des lignées cellulaires à ce stade. Si le temps est inférieur à 30 minutes, il y a un risque de perdre des agrégats qui ne se sont peut-être pas déposés au fond du tube conique de 15 mL.
5. Après 30 min, avec prudence, aspirez le surnageant avec une pipette ou une pompe d’aspiration haute sensibilité. Assurez-vous que les agrégats ne sont pas perturbés au fond du tube conique de 15 mL.
6. Resuspendre les agrégats de chaque tube conique de 15 mL dans 2 mL de milieu d’induction vasculaire et les remettre dans leurs puits respectifs de la plaque de culture à 6 puits à très faible attache.
7. Replacez la plaque dans l’incubateur (37 °C) et laissez-la jusqu’au jour 6.
   REMARQUE : À l’aide d’une pipette de 1 mL, pipeter doucement chaque puits d’agrégats de haut en bas une fois par jour pour garder les agrégats de taille similaire et les empêcher de se développer ou de se fixer les uns aux autres.

6. Jour 6 - Encastrement des agrégats et induction des germes vasculaires

1. Pendant que vous travaillez sur la glace, préparez le volume final souhaité de la solution ECM (étape 1.5).
   REMARQUE : Voici le protocole pour un puits d’une plaque de 12 puits (30 à 50 agrégats), qui peut être ajusté au besoin.
   1. Pour un puits d’une plaque de 12 puits, appliquez 0,5 mL d’ECM comme couche inférieure et utilisez 0,5 mL d’ECM plus agrégats sur la couche supérieure. Cela crée le « sandwich » ECM nécessaire à une germination efficace des agrégats 3D.
2. Pipeter 500 μL d’ECM dans un puits d’une plaque de 12 puits. Assurez-vous qu’aucune bulle ne se forme et que le ménisque inférieur et latéral du puits est complètement recouvert d’un revêtement. Celle-ci comprend la couche 1 du sandwich ECM.
3. Replacer la plaque à 37 °C pendant 2 h.
   NOTE: Un temps de 2 h est nécessaire pour une polymérisation efficace. Tout temps plus court risque de compromettre l’intégrité de l’ECM.
4. Vers la fin de la polymérisation de la couche 1, utilisez un mouvement circulaire pour rassembler les agrégats au centre de chaque puits, utilisez une pipette de 1 mL pour recueillir doucement les agrégats et le milieu environnant de chaque puits et placez-les dans leurs tubes coniques correspondants de 15 mL.
5. Laissez les agrégats se déposer pendant 10-15 minutes et aspirez le surnageant.
6. Placer les agrégats dans le tube conique de 15 ml sur de la glace pendant 5 min. Pendant le refroidissement, sortez la plaque de 12 puits avec la couche 1 maintenant polymérisée de l’incubateur.
   REMARQUE: Le refroidissement des agrégats aide à prévenir la polymérisation précoce de la couche 2 ECM.
7. Travailler rapidement et prudemment pour éviter la formation de bulles, remettre en suspension les agrégats dans 500 μL d’ECM et pipeter la suspension ECM-agrégat sur la couche 1 déjà polymérisée. En faisant attention à ne pas toucher la couche 1, utilisez une pointe de pipette de 200 μL pour répartir délicatement la couche 2 et les agrégats autour du puits.
8. Replacer la plaque à 37 °C pendant 2 h.
   REMARQUE: Un temps d’incubation de 2 h est nécessaire pour une polymérisation ECM efficace. Tout temps plus court risque de compromettre l’intégrité de l’ECM et peut empêcher une forte adhérence entre la couche 1 et la couche 2.
9. Ajouter 1 mL de milieu de germination préchauffé (37 °C) (étape 1.6) pour induire la différenciation des vaisseaux sanguins. Les récipients en germination doivent apparaître 1 jour à 3 jours après l’encastrement. Changez le support après 3 jours, puis tous les deux jours.
   NOTE: Le milieu de germination doit être préchauffé; sinon, le détachement de la couche peut se produire et l’intégrité de l’ECM peut être affectée.

7. Jour 11 - Isolement et maturation des BVO

1. Travailler dans des conditions stériles, utiliser l’extrémité arrondie d’une spatule stérile pour desserrer la matrice de germination ECM contenant les réseaux vasculaires. À ce stade, le gel doit ressembler à un disque flottant.
   1. À l’aide de pinces stériles et de l’extrémité arrondie d’une spatule stérile, transférer délicatement le disque de gel (y compris les réseaux vasculaires) sur le couvercle d’une boîte de culture de 10 cm.
2. Placez le couvercle plus le gel sous un stéréomicroscope ajusté au grossissement et à la mise au point souhaités, et utilisez des aiguilles stériles pour couper les réseaux de vaisseaux sanguins individuels, en essayant de limiter la quantité d’ECM non vascularisée obtenue dans le processus.
   REMARQUE: Les cellules dégradent naturellement l’ECM environnant au fil du temps; Cependant, la réduction de la quantité découpée avec chaque organoïde augmente la qualité de l’image et l’intégrité du réseau de navires autonomes.
3. Une fois que tous les organoïdes ont été isolés du gel, transférez-les doucement dans un puits d’une plaque de 6 puits à fixation ultra-basse avec 3 mL de milieu de germination. À ce stade, les organoïdes peuvent être laissés pendant la nuit, ou on peut immédiatement passer à l’étape 7.4.
4. Utilisez une pipette de 1 mL pour transférer les organoïdes simples de la plaque à 6 puits vers les puits d’une plaque à très faible fixation de 96 puits. Une fois transféré, ajouter 200 μL de milieu de germination préchauffé (37 °C) à chaque puits de la plaque de 96 puits.
   NOTE: Un puits d’organoïdes vasculaires d’une plaque de 12 puits doit remplir 30 à 40 puits d’une plaque de 96 puits.
5. 4 à 6 jours après l’isolement dans les plaques à 96 puits, s’assurer que les organoïdes possèdent une morphologie ronde et saine. À ce stade, les organoïdes sont prêts à être fixés et préparés pour la coloration.

8. Jour 15 - Fixation, blocage et coloration des BVO

1. À l’aide d’une pointe coupée de 1 mL, transférer les organoïdes dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
2. En prenant soin d’éviter l’aspiration de tout BVO, utilisez une pipette de 200 μL ou 1 000 μL pour éliminer le milieu germinatif restant dans le tube de microcentrifugeuse, puis ajoutez 1 mL de PFA à 4 % dans du PBS pendant 1 h.
   NOTE: La fixation sur un agitateur orbital (125 tr / min) à température ambiante est recommandée. Un maximum de 60 BVO/tube microcentrifuge est acceptable. Tout autre BVO nuira à l’efficacité de la fixation et du lavage.
   ATTENTION : Le PFA est un produit chimique nocif. Utilisez-le avec prudence dans une hotte aspirante et suivez le mode d’emploi du fabricant et les méthodes d’élimination appropriées.
3. Lavez les BVO nouvellement fixés 3x pendant 15 minutes à chaque fois avec 0,25% PBS-Tween.
4. Si les organoïdes ont un diamètre supérieur à 1 mm, perméabiliser les BVO avec 1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 30-60 min à température ambiante.
5. Aspirer tout le PBS-Tween à 0,25 % et ajouter 1 mL de tampon bloquant (étape 1.7).
   REMARQUE: Bien que dépendante des anticorps, 2 heures à température ambiante sur un agitateur orbital (125 tr / min) sont suffisantes pour réduire la liaison des anticorps non spécifiques pendant le processus de coloration. Les organoïdes peuvent être laissés dans le tampon de blocage à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
6. Retirer le tampon bloquant et ajouter l’anticorps primaire (1:100) dilué dans 1 mL du tampon bloquant. Conserver toute la nuit à 4 °C sur un agitateur orbital (12 tr/min), en veillant à ce que les organoïdes restent immergés dans la solution d’anticorps primaires.
   REMARQUE : L’incubation nocturne d’anticorps primaires convient aux anticorps utilisés pour cette étude. Les anticorps primaires et secondaires nécessaires et leurs dilutions respectives sont indiqués dans le tableau des matières.
7. Après une incubation nocturne d’anticorps primaires, retirer la solution d’anticorps primaires et laver 3x pendant 15 minutes à chaque fois avec du PBS-Tween à 0,25 %.
8. Ajouter l’anticorps secondaire (1:250) plus DAPI (1:1 000) dilué dans 1 mL de tampon bloquant, et incuber pendant 2 h à température ambiante ou à 4 °C pendant une nuit.
   NOTE: Si les échantillons sont préparés correctement (comme décrit ci-dessus), l’incubation pendant 2 h à température ambiante ou à 4 °C pendant la nuit convient aux anticorps utilisés dans la présente étude.
9. Après l’incubation, retirer la solution d’anticorps secondaires et laver 3x pendant 15 minutes à chaque fois avec 0,25% de PBS-Tween.
   REMARQUE: Après la coloration, les organoïdes peuvent être conservés dans PBS jusqu’à 2 semaines.

9. Montage des organoïdes des vaisseaux sanguins (BVO)

1. Collez les entretoises de montage sur les lamelles d’imagerie souhaitées (voir le tableau des matériaux).
2. À l’aide d’une pointe de pipette coupée de 1 mm, utilisez une pipette de 1 mL pour transférer des organoïdes simples dans les puits d’espacement et aspirer le PBS restant.
3. Remplir le puits avec 150-200 μL de solution de nettoyage (voir Tableau des matériaux) chauffée à 75 °C, en submergeant complètement l’organoïde.
   NOTA : Les échantillons doivent devenir clairs dans les 1 heures suivant l’exposition à la solution de nettoyage chauffée.
   1. Laisser les organoïdes devenir clairs dans une boîte couverte à l’obscurité à température ambiante pendant 6 h à toute la nuit si le temps de dégagement de 1 h est insuffisant. Si vous laissez l’échantillon pendant la nuit, assurez-vous qu’il a suffisamment de solution de nettoyage pour éviter le dessèchement.
4. Après le nettoyage, aspirez soigneusement la solution de nettoyage avec un embout de pipette de 100 à 200 μL. Manœuvrer doucement l’organoïde au centre du puits d’espacement et ajouter des gouttes de gel de montage (voir Tableau des matériaux) (chauffé à 75 °C dans un bloc chauffant contrôlé) jusqu’à ce que le puits soit plein.
5. Placez délicatement le deuxième couvercle sur le dessus de l’entretoise de montage pour sceller les échantillons dans l’espace entre les lamelles de couvercle inférieure et supérieure. Laissez le gel de montage durcir dans l’obscurité à 4 °C pendant la nuit.
   REMARQUE: Après le durcissement, du vernis à ongles de finition peut être utilisé pour sceller davantage les échantillons montés.

Résultats

Les étapes décrites dans ce protocole ont été développées spécifiquement pour produire une méthode contrôlée et précise pour la génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de CSPh. La génération d’agrégats de 30 à 100 μm de diamètre à partir de cultures de CSPh marque le point de départ du protocole (Figure 1, Figure 2B). Les agrégats sont conduits par étapes vers le mésoderme (jour 1-jour 4) et les lignées vasculaires (jour 4-jour 6) avant l’incorporation (jour 6) (Figure 2A-D), qui est nécessaire à la formation du réseau de vaisseaux. La germination d’un vaisseau à symétrie quasi radiale doit être visible par d7 ou d8 (figure 2E) et se poursuivre par d10 (figure 2F,G). L’explantation des hBVO de l’ECM vers les plaques de fixation ultra-basses à 96 puits réduit la fragilité des réseaux de germination et permet une maintenance continue dans des conditions de culture en suspension (Figure 2H) jusqu’à 6 mois. À d15, les hBVO présentent un réseau endothélial étendu et connecté (CD31+) entouré de péricytes (PDGFR-ß+) et d’actine du muscle lisse (SMA⁺) (Figure 3A-D). Une membrane basale continue de collagène IV (ColIV⁺) enveloppe les réseaux de vaisseaux (Figure 3E). Les cellules endothéliales (CD31+, VE-Cadhérine+) et les péricytes (PDGFR-ß⁺) représentent respectivement environ 30 % à 35 % et 60 % à 65 % des populations de cellules organoïdes. La germination active des vaisseaux se produit sous la direction d’une population de cellules de pointe organisées de manière endogène (CD31⁺) qui présente une morphologie typique des cellules de pointe, comme un excès de filipodia ^8,10. La présentation des cellules murales PDGFR-ß+ et SMA⁺ encapsulant les réseaux de vaisseaux endothéliaux peut être vue par d15 du processus de maturation organoïde (Figure 3A,C). Après le retrait de l’ECM et la maturation en culture en suspension (c.-à-d. d15), les BVO h sont valables pour les analyses respectives ou la transplantation sous la capsule rénale de souris.

Figure 1 : Schéma du protocole hBVO mettant en évidence le timing et la progression par étapes. À partir de cultures apparemment homogènes de CSPh ou de CSPhi, la formation d’agrégats se produit en présence de l’inhibiteur de la rho-kinase Y27632. Le milieu BMP4 et supplémenté en CHiR est utilisé pour diriger les agrégats vers le devenir mésodermique. Le milieu d’induction du mésoderme est remplacé par le VEGFA et le milieu supplémenté en forskoline pour stimuler les agrégats vers une lignée vasculaire. Les files d’attente mécaniques et chimiques obtenues grâce à l’incorporation des agrégats dans une matrice de membrane basale de collagène I et solubilisée et à l’exposition à un milieu contenant du VEGFA et du FGF2 entraînent une germination vasculaire presque radiale symétrique à partir du corps agrégé. Les réseaux de vaisseaux générés peuvent être retirés du collagène I et de la membrane basale solubilisée et placés en culture en suspension pour une maturation, une analyse ou une transplantation ultérieure in vivo. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Progression par étapes de la génération hBVO capturée sous fond clair. (A) Morphologie typique des colonies hPSC (H9) au jour −1. (B) Génération d’agrégats hPSC (jour 0) sur des plaques de fixation ultra-basses à 6 puits en présence de Y-27632. (C) L’induction mésodermique d’agrégats à l’aide de BMP4 et d’un milieu supplémenté en ChiR (jour 1). Des changements subtils dans la taille et la forme de l’agrégat peuvent également être observés. (D) Les agrégats du jour 4 amorcés vers une lignée vasculaire en utilisant le VEGFA et un milieu supplémenté en forskoline. (E) Germination précoce du vaisseau le jour 7, un jour après l’incorporation des agrégats dans la matrice de germination et l’exposition au milieu de germination supplémenté en VEGFA et FGF2 (jour 7). (F) Morphologie organoïde saine et germination continue des vaisseaux au jour 9. G) Navire à un stade avancé poussant au jour 10. Idéalement, les structures cellulaires denses au centre organoïde ont disparu à ce moment-là. (H) Morphologie typique des organoïdes des vaisseaux sanguins humains matures (jour 15). L’élimination de la matrice environnante par coupe et maturation dans des plaques de culture à 96 puits à très faible attachement façonne les organoïdes de manière sphérique, les réseaux de vaisseaux étant logés à l’intérieur. Barres d’échelle: (A,B,E,F) 250 μm; C,D) 500 μm; (G,H) 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Coloration en montage entier des organoïdes des vaisseaux sanguins humains matures (jour 15). (A) Présentation d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains matures (jour 15) avec des réseaux endothéliaux auto-organisés (CD31+, magenta) et une couverture péricytaire environnante (PDGFR-β⁺, cyan) et d’actine musculaire alpha-lisse (SMA⁺, jaune). (B) Grossissement plus élevé de A détaillant l’expression SMA⁺ (jaune) et PDGFR-β⁺ (cyan) des réseaux de récipients. (C) Présentation détaillée de l’interaction endothéliale (CD31+, magenta), péricytaire (PDGFR-β⁺, cyan) et de l’actine musculaire alpha-lisse (SMA⁺, jaune). (D) Coloration intégrale de l’interaction endothéliale (CD31+, magenta)-muscle lisse (SMA⁺, jaune) dans une section transversale (à gauche) et un grossissement plus élevé (à droite) des organoïdes des vaisseaux sanguins matures. (E) Formation autodirigée d’une membrane basale vasculaire (Col ^IV+, niveaux de gris) par association étroite des cellules murales et des tubes endothéliaux. Barres d’échelle: (A,D[gauche]) 100 μm; (B,D[droite],E) 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Des percées récentes dans les cultures organoïdes dérivées de cellules souches ont fourni le cadre pour des modèles plus avancés et physiologiquement pertinents du système vasculaire humain. Le modèle organoïde des vaisseaux sanguins humains (hBVO) présenté ici, développé dans notre laboratoire 8,10, fournit un moyen puissant d’explorer non seulement d’autres aspects de la vasculogenèse humaine, mais aussi de nouvelles voies de modélisation de la maladie et de thérapie régénérative 8,10,11. Plusieurs modèles in vivo ont été utilisés pour explorer le développement et la maturation des vaisseaux sanguins, des maladies vasculaires et du dysfonctionnement endothélial ^3,4. Diverses approches combinent des cellules définies par une lignée unique et multiple, dérivées de cellules souches, soit isolées de tissus adultes in vivo pour créer des réseaux vasculaires humains réplicatifs ^5,6. Le protocole présenté ici tire parti du principe de la biologie du développement et de l’auto-organisation pour produire les tout premiers réseaux de vaisseaux sanguins humains de lignées multicellulaires pouvant être générés, en substance, à partir d’un seul hPSC ^8,10.

Chaque lignée de cellules souches a une constitution génétique unique et diffère des autres en termes de provenance, de fonction et de réactivité¹⁵. Par conséquent, le protocole pour les organoïdes des vaisseaux sanguins humains (hBVO) a été développé et optimisé pour assurer une compatibilité de protocole robuste et reproductible avec plusieurs (>12) lignées différentes de CSPh ^8,10. La méthode décrite ici génère des organoïdes de vaisseaux sanguins dérivés de hPSC sur 2 semaines. Cependant, des modifications de la composition du milieu et/ou des techniques de génération d’hBVO peuvent entraîner une inefficacité du réseau de vaisseaux et de la génération d’organoïdes. Les taux de prolifération variables des lignées individuelles de cellules souches ont également une incidence marquée sur la reproductibilité de l’expérimentation sur les cellules souches¹⁵ et, par conséquent, des cultures organoïdes. Par exemple, lors de la génération des BVO, des cellules plus prolifératives ou un nombre plus élevé de grands agrégats du jour 1 sont intrinsèquement soumis à différents environnements métaboliques et paramètres de diffusion des gaz et des nutriments. Ceci, à son tour, modifie les temps d’exposition et l’efficacité des facteurs de croissance, le degré de différenciation et d’amorçage vasculaire et, surtout, la capacité de former des réseaux de vaisseaux lors de l’incorporation des agrégats dans le collagène 1 et la matrice membranaire basale solubilisée.

La diffusion passive de l’oxygène et l’administration de nutriments essentiels provenant d’un environnement extérieur ne sont pas idéales pour la croissance cellulaire à long terme des organoïdes 3D et la morphogenèse tissulaire in vitro¹⁶. Bien que dépendant de plusieurs facteurs (c.-à-d. le taux métabolique tissulaire, la biodisponibilité des nutriments et des gaz, un environnement statique ou dynamique), une limite générale de diffusion de 150 μm_O2 et des nutriments a été établie pour les tissus cultivés in vitro, étant donné que, physiologiquement, les tissus humains présentent des cordons de cellules vivantes à moins de 150 μm des vaisseaux sanguins perfusés¹⁷. Bien que des distances effectives de diffusion des gaz et des nutriments de 70 à 200 μm aient également été proposées^18,19,20,21, la densité de construction^, la température, le pH et la composition du milieu ont un impact significatif sur l’efficacité de la diffusion. En raison de l’optimisation de la surface et de la communication intégrine-récepteur bêta après l’encastrement du jour 6, les agrégats de 250 à 300 μm de diamètre donnent de meilleurs résultats que ceux de > 500 à 600 μm de diamètre, ce qui entraîne un processus complet de germination des vaisseaux et un noyau organoïde peu condensé. Ainsi, la taille de l’agrégat est cruciale et peut être affectée à la fois par le nombre de cellules utilisées lors de l’ensemencement initial et par le temps alloué à la formation des agrégats. Les plaques de micropuits qui permettent de contrôler la taille des agrégats et le nombre²² sont une alternative viable à la technique de formation d’agrégats autrement stochastique résultant de l’utilisation de plaques à 6 puits à très faible attachement dans ce protocole. La cohérence dans le calendrier et la gestion des tailles agrégées au cours des 6 premiers jours du protocole hBVO est l’un des indicateurs cruciaux, sinon le plus, du développement réussi d’organoïdes de vaisseaux sanguins de bonne foi.

Les changements de milieu au jour 1 (induction du mésoderme) et au jour 4 (induction vasculaire) doivent être effectués en combinaison avec la sédimentation des agrégats. Bien que la centrifugation soit une alternative tentante, les forces supplémentaires appliquées aux exagérations faiblement assemblées peuvent provoquer une agglutination, un assemblage et un cisaillement indésirables, ce qui a un impact négatif sur la différenciation, la maturation et l’efficacité de la germination dans les dernières étapes du protocole. Travailler sur la glace pendant le processus d’encastrement du jour 6 est essentiel pour préserver la polymérisation ECM et la formation de couches. Pendant l’encastrement des agrégats et l’induction de germination, l’exposition de l’ECM à des températures supérieures à 4 °C et/ou à un pH ECM autre que 7,4 affectera non seulement les taux de polymérisation et l’intégrité de la couche ECM, mais aussi l’efficacité de germination des agrégats incorporés. La nature élastique de la matrice de germination ECM permet un détachement et un transport faciles de la boîte de culture à 12 puits à la surface de coupe stérile. Les organoïdes individuels retirés de la matrice et transférés sur des plaques à 96 puits à très faible fixation consommeront l’ECM environnant restant et conserveront des réseaux de microvaisseaux endothéliaux auto-organisés recouverts de cellules murales avec une membrane basale continue.

Bien qu’elles ne soient pas couvertes par la présente proposition, les modifications apportées à la composition des milieux peuvent reproduire des maladies qui, à leur tour, provoquent des réponses pathologiques dans les hBVO ^8,11. Les limites de la modélisation des maladies à l’aide du système hBVO sont loin d’être bien connues, et c’est certainement un domaine qui doit être exploré. L’application de notre technologie organoïde des vaisseaux sanguins dans la vascularisation de constructions organoïdes précédemment avasculaires²³ a également un impact et un intérêt significatifs.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630080
2-Mercaptoethanol	Millipore	60-24-2
7.5% sodium bicarbonate	Gibco	5080094
Accutase	Gibco	A1110501	cell dissociation reagent
Albumin fraction V (BSA)	AppliChem	A1391, 0100
Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment	—	Jackson Immuno Research	711-546-152
Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG	—	Life Technologies	A11015
Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment	—	Jackson Immuno Research	705-606-147
Automated cell counter	Invitrogen		Countess II
B27 supplement	Gibco	12587010
Biological safety cabinet	Faster		SafeFAST Premium 212
BMP4	Miltenyi BioTec	130-111-165
CD31	Endothelial cell	DAKO	M0823
CD31	Endothelial cell	R&D	AF806
Cellulose wipes
Centrifuge	Heraeus		Multifuge 4 KR
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423
Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)
CO2 incubator	New Brunswick		Galaxy 170S
Collagen type IV	Basement membrane	Millipore	AB769
Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)	Leica		SP8
Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue	Invitrogen	C10283
Coverslips (22 x 50 mm)
Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment	—	Jackson Immuno Research	715-166-150
DAPI	Sigma	D9542
DMEM/F12	Gibco	11330-032
Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM)	Sigma	D5648-10L
Eppendorf tubes
Falcon tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fetal Bovien Serum (FBS)	Gibco	10270-106
FGF2	Miltenyi BioTec	130-093-841
Fine forceps	FST	11254-20
Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides	Fisher Scientific	12-550-016
Forskolin	Sigma	F3917
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Fisher Scientific	A1413302
Glutamax	Gibco	35050061
Ham's F12	Gibco	11765054
Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC	Thermo Scientific		Heraguard
Inverted contrasting tissue culture microscope	Zeiss		Vert.A1
iSpacer	SunJinLab	IS009
KnockOut DMEM/F12	Gibco	12660012
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
N2 supplement	Gibco	17502048
Neurobasal medium	Gibco	21103049
non-essential amino acids (NEAAs)	Gibco	11140035
Orbital shaker
Parafilm
Paraformaldehyde (4%) in PBS	Boston BioProducts	BM-155
PDGFR-β	Pericyte	R&D	AF385
PDGFR-β	Pericyte	Cell Signaling	3169S
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
pH indicator strips (6.5-10)	Mquant, Millipore	109543
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Pipettes (P1000, P200 and P20)	Gilson, Integra Pipetboy
Prime Surface-U 96-well plates	Sumilon	MS9096-U
PurCol	Advanced BioMatrix	5005
RapiClear CS gel	SunJinLab	RCCS005
RapiClear CS mounting solution	SunJinLab	RCCS002
Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)	Falcon	357529, 357530, 357515
SMA	vSMC/Pericyte	Sigma	2547
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)	Sigma	S2770
Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)	Corning	356231
Stainless steel micro spatula (rounded end)	Fisher Scientific	21-401-5
Stainless steel spoon (double-ended)	Fisher Scientific	BelArt H367290018
Stemflex medium	Thermo Scientific	A3349401	stem cell culture medium
StemPro-34 SFM	Gibco	10639011	flexible serum-free medium
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000
Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL)	Biozym, Surphob	VT0270, VT0250, VT0220
Tissue culture–treated 12-well plates TC	BD Falcon	353043
Tissue culture–treated 6-well plates	Eppendorf	30720113
Triton X-100	Sigma	93420
Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red	Thermo Scientific	12605010	mammalian cell dissociating enzyme
Tween 20	Sigma	P7949
Ultra-low-attachment 6-well plates	Corning	3471
VEGFA	Peprotech	100-20
Water bath (37 °C)	Fisher Scientific		Isotemp 210
Y-27632	Calbiochem	688000