Un modèle organoïde cérébral humain de transplantation de cellules neurales

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour la transplantation et le suivi de cellules neurales marquées dans des organoïdes cérébraux humains.

Résumé

L’avancement des approches de transplantation cellulaire nécessite des systèmes modèles qui permettent une évaluation précise de la puissance fonctionnelle des cellules transplantées. Pour le système nerveux central, bien que la xénotransplantation reste à la pointe de la technologie, de tels modèles sont techniquement difficiles, limités en débit et coûteux. De plus, les signaux environnementaux présents ne réagissent pas parfaitement avec les cellules humaines. Cet article présente un modèle peu coûteux, accessible et compatible à haut débit pour la transplantation et le suivi de cellules neurales humaines dans des organoïdes cérébraux humains. Ces organoïdes peuvent être facilement générés à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme à l’aide de kits commerciaux et contiennent les principaux types de cellules du cerveau.

Nous démontrons d’abord ce protocole de transplantation avec l’injection de cellules progénitrices neurales (NPC) humaines dérivées d’iPSC marquées à l’EGFP dans ces organoïdes. Nous discutons ensuite des considérations relatives au suivi de la croissance de ces cellules dans l’organoïde par microscopie à fluorescence de cellules vivantes et démontrons le suivi des NPC transplantés marqués à l’EGFP dans un organoïde sur une période de 4 mois. Enfin, nous présentons un protocole de sectionnement, de coloration immunofluorescente cyclique et d’imagerie des cellules transplantées dans leur contexte local. Le modèle de transplantation organoïde présenté ici permet le suivi à long terme (au moins 4 mois) des cellules humaines transplantées directement dans un microenvironnement humain avec un protocole peu coûteux et simple à réaliser. Il représente donc un modèle utile à la fois pour les thérapies cellulaires neurales (greffes) et, probablement, pour modéliser les tumeurs du système nerveux central (SNC) d’une manière plus précise sur le plan microenvironnemental.

Introduction

Le cerveau humain est un organe complexe composé de plusieurs types de cellules des lignées neurales et gliales. Ensemble, ils forment un réseau sophistiqué qui donne naissance à la cognition. La transplantation de cellules dans ce système suscite un intérêt important pour traiter une grande variété de troubles neurologiques, notamment les traumatismes crâniens (TCC)^1,2, les troubles neurodégénératifs 3,4,5,6,7 et les accidents vasculaires cérébraux 8 . L’une des principales limites à l’avancement de telles stratégies, cependant, est le manque relatif de modèles précliniques disponibles pour déterminer les résultats attendus de la transplantation. Les modèles les plus utilisés actuellement sont les méthodes de culture in vitro pour déterminer le potentiel cellulaire et la xénotransplantation chez la souris. Bien que les méthodes de culture cellulaire puissent évaluer le potentiel de différenciation et d’auto-renouvellement⁹, elles sont réalisées dans des conditions de croissance optimales qui n’imitent pas le microenvironnement que les cellules rencontreraient dans un contexte de transplantation. De plus, la façon dont les cellules sont cultivées peut influencer leur comportement¹⁰.

Le cerveau des souris contient toutes les cellules du microenvironnement et constitue donc un système modèle extrêmement puissant pour la transplantation¹¹. Il existe cependant des différences importantes entre la souris et le cortex humain^12,13, et tous les facteurs de croissance ne réagissent pas de manière croisée entre les espèces. Les modèles de primates sont une alternative plus proche qui imite mieux le système humain et ont également donné d’importants résultats précliniques¹⁴. Cependant, même ces parents plus étroitement apparentés conservent des différences importantes dans leur composition cellulaire¹⁵. Bien que ces deux systèmes modèles fournissent des informations précieuses sur le comportement des cellules pendant la greffe et intègrent les éléments chirurgicaux d’une éventuelle thérapie, ils restent imparfaits. Ils sont également coûteux et techniquement difficiles (c’est-à-dire qu’il faut effectuer une chirurgie cérébrale sur les animaux), limitant ainsi le débit possible. De plus, il existe une pléthore de problèmes éthiques associés à la transplantation de cellules cérébrales humaines chez des animaux¹⁶. Les cultures de tranches de cerveau permettent de couper un cerveau et de l’utiliser pour plusieurs traitements, éliminant ainsi certaines des limites des greffes d’animaux ; cependant, celles-ci ont une durée de vie limitée (semaines), sont toujours d’origine animale et (étant une tranche mince) n’ont pas un volume/une intégrité de surface suffisant pour imiter l’injection de cellules¹⁷. Ainsi, il reste un écart important entre la culture cellulaire/les modèles potentiels et la transplantation in vivo.

Les organoïdes cérébraux sont un modèle in vitro contenant les principaux types de cellules neurales présentes dans le cerveau et peuvent être générés en grand nombre à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (^CSPi)18,19. De tels organoïdes fournissent ainsi un contexte cellulaire, qui pourrait permettre l’évaluation de la capacité fonctionnelle d’une cellule test d’intérêt dans le cadre de la transplantation. En effet, une étude récente a démontré que les cellules progénitrices neurales (NPC) transplantées dans des organoïdes cérébraux humains survivent, prolifèrent et se différencient de la même manière que les NPC transplantées dans le cerveau d’une sourisdiabétique obèse et immunodéficiente (NSG)²⁰. Les organoïdes cérébraux représentent donc un système sans cruauté, à longue durée de vie (>6 mois) et rentable qui capture les types de cellules du cerveau humain. En tant que tels, ils pourraient représenter un receveur de greffe idéal pour le test précoce de la capacité de régénération des cellules neurales.

Cet article présente un protocole pour la transplantation et le suivi ultérieur de NPC humains marqués dans des organoïdes cérébraux humains (Figure 1). Cela commence par l’injection de NPC marqués à la GFP dans des organoïdes cérébraux matures (âgés de 2 à 4 mois)¹⁸. Les cellules transplantées sont ensuite suivies d’une microscopie à fluorescence sur cellules vivantes sur une période de 4 mois. Pendant ce temps, nous montrons à la fois la persistance des cellules au site d’injection mais aussi la migration vers les régions distales de l’organoïde. Au point final, nous démontrons la récupération d’antigènes, la coloration et l’imagerie de coupes histologiques dérivées de ces organoïdes, y compris un protocole pour la trempe des colorants existants à base d’AlexaFluor pour permettre des cycles de coloration et d’imagerie supplémentaires, sur la base de travaux antérieurs²¹. Ce protocole pourrait donc être utile pour mesurer la capacité de différenciation des cellules dans un contexte de greffe, la durabilité du greffon, l’expansion cellulaire in situ et la migration cellulaire à partir du site de greffe. Nous prévoyons que cela sera utile à la fois pour les applications de médecine régénérative/thérapie cellulaire, ainsi que pour la modélisation tumorale en greffant des cellules tumorales dans des organoïdes spécifiques à une région pertinente.

Protocole

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Marquage fluorophore des cellules par transduction lentivirale

1. Décongeler une aliquote de la matrice de membrane basale solubilisée de votre choix sur de la glace.
2. Pendant que l’aliquote dégèle, ajoutez de l’eau stérile pour combler les espaces entre les puits dans une plaque de 24 puits, ainsi que tous les puits extérieurs.
   REMARQUE : Cela laisse huit puits ouverts au milieu pour l’utilisation et garantit que les cellules restent dans une humidité élevée, minimisant ainsi la variabilité induite par l’évaporation.
3. Diluer la matrice solubilisée de la membrane basale 1:100 dans un milieu DMEM/F12 glacé (une concentration finale de 0,089 mg/mL a été obtenue avec le lot utilisé ici).
4. Ajouter 300 μL de la matrice de membrane basale solubilisée diluée dans l’un des puits du milieu (ouverts) de la plaque de 24 puits préparée par infection à effectuer. Assurez-vous de couvrir uniformément tout le fond du puits et d’en ajouter plus, si nécessaire, pour assurer un revêtement uniforme.
5. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 °C pour permettre à une couche de se solidifier le long du fond du puits. Vérifiez à la fin de cette incubation que le liquide recouvre toujours entièrement le fond du puits et ne s’est pas évaporé au centre. L’évaporation est un signe que l’humidité est trop faible ; Si cela se produit, répétez le revêtement.
   REMARQUE : Les plaques peuvent être recouvertes la veille et laissées dans une matrice de membrane basale solubilisée diluée sans effets nocifs évidents ; Cependant, le risque d’évaporation est considérablement accru, ils doivent donc être soigneusement inspectés avant utilisation.
6. Retirez le milieu d’un puits de NPC confluents dérivés d’iPSC poussant dans une plaque de puits.
   REMARQUE : Pour cet article, des progéniteurs neuronaux dérivés d’iPSC produits à l’aide d’un kit commercial selon les instructions du fabricant entre le passage 3 et le passage 10 ont été utilisés.
7. Ajouter délicatement 1 ml de PBS sur le côté du puits et basculer la plaque pour assurer un lavage uniforme.
8. Retirez le PBS et remplacez-le par 300 μL du mélange d’enzymes protéolytiques-collagénolytiques, en secouant à nouveau la plaque pour s’assurer qu’il recouvre complètement le fond du puits. Incuber 5 min à 37 °C. Vérifiez que les cellules se détachent de la surface de la plaque par microscopie optique.
9. À l’aide d’une pipette P1 000, ajoutez 700 μL de DMEM/F12 et détachez les cellules en pulvérisant ce mélange sur toutes les surfaces du fond de la plaque. Pipeter de haut en bas pour s’assurer que les agrégats cellulaires sont brisés en une suspension unicellulaire uniforme. Prélever les cellules et les ajouter à 9 mL de milieu DMEM/F12 dans un tube conique de 15 mL.
10. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min.
11. Pendant ce temps, préparer suffisamment de milieu complété par 10 μM d’Y-27632 pour 500 μL par puits à plaquer, plus 1 mL pour la remise en suspension.
    NOTE : Y-27632 est nécessaire pour assurer une survie élevée des PNJ après leur passage en tant que cellules uniques.
12. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu supplémenté en Y-27632, en pipetant doucement de haut en bas plusieurs fois pour briser les agrégats cellulaires.
13. Prélevez quelques microlitres de cellules, et diluez-les (1:5 à 1:10) dans du bleu trypan.
14. Comptez les cellules viables (bleu trypan négatif) sur un hémocytomètre. Ajustez la dilution du bleu trypan pour obtenir au moins 50 cellules viables par quadrant de l’hémocytomètre afin de vous assurer que les numérations sont exactes. Calculez le volume de suspension cellulaire nécessaire pour que 100 000 cellules soient présentes dans chaque puits.
15. Mélangez doucement les cellules de haut en bas par pipetage et prenez le volume calculé (pour 100 000 cellules par puits). Ajoutez cela au milieu supplémenté en Y-27632 (à partir de l’étape 1.11) de sorte que le volume final soit de 500 μL par puits à plaquer.
16. Retirer la matrice de membrane basale solubilisée diluée des puits précédemment recouverts (en supposant que l’incubation de 30 minutes ou plus est terminée).
17. Mélanger délicatement les cellules par pipetage et ajouter 500 μL de suspension cellulaire dans chaque puits.
18. Pour répartir uniformément les cellules, déplacez la plaque dans un grand mouvement de signe « + » avec de légers balayages linéaires (avant-arrière, arrêt, arrière-arrière) immédiatement avant de la placer dans un incubateur de culture cellulaire.
19. Incuber pendant une nuit (16-24 h) à 37 °C et 5 % de CO₂.
20. Retirez le milieu et ajoutez le lentivirus titré. Si des événements d’intégration uniques sont nécessaires, viser une multiplicité d’infection de 0,3 unité infectieuse par cellule (idéalement titrée sur les cellules d’intérêt) et compléter jusqu’à 500 μL dans le milieu (sans Y-27632).
    REMARQUE : Le lentivirus d’intérêt peut être acheté pré-titré ou produit en interne comme cela a été fait précédemment²². Ici, un lentivirus GFP produit en interne avec une résistance à la puromycine a été utilisé pour générer et sélectionner les NPC exprimant l’EGFP. Si le lentivirus n’a pas été titré sur les cellules d’intérêt et que le nombre de copies est critique, il est recommandé d’ajouter plusieurs volumes à quelques puits et d’utiliser plus tard le puits contenant ~30 % de cellules EGFP⁺ 48-72 h. Si le nombre de copies n’est pas critique, un excès de virus peut être ajouté avec la mise en garde que la mutagenèse insertionnelle peut entraîner un comportement anormal chez certains clones. ATTENTION : Les vecteurs lentiviraux présentent un danger biologique de niveau 2-3 (selon leur contenu). Respectez les réglementations locales en matière de biosécurité pour la manipulation du lentivirus, la décontamination des surfaces et des objets en plastique, ainsi que les déchets liquides.
21. Remettre les cellules dans l’incubateur et les incuber pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
22. Retirez les cellules de l’incubateur et retirez le surnageant.
    ATTENTION : Comme le surnageant des cellules contient encore des particules lentivirales à ce stade, continuez à suivre les réglementations locales en matière de biosécurité pour sa manipulation et son élimination.
23. Rincer les cellules avec 2 x 500 μL de PBS en ajoutant doucement du PBS à la paroi du puits ; Ensuite, retirez du coin du puits pour éliminer tout lentivirus restant.
    ATTENTION : Comme le surnageant des cellules contient encore des particules lentivirales à ce stade, continuez à suivre les réglementations locales en matière de biosécurité pour sa manipulation et son élimination.
24. Passer à 500 μL de milieu frais (sans Y-27632) et continuer à croître à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit.
25. Utilisez la microscopie à fluorescence de cellules vivantes pour vérifier la proportion de cellules qui expriment l’EGFP et sélectionner le puits avec lequel procéder.
26. Si le vecteur lentiviral choisi contient une cassette de sélection (gène de résistance aux antibiotiques tel que la résistance à la puromycine), ajoutez l’agent de sélection (ici, 1 μg/mL de puromycine) au milieu à une dose préalablement validée qui tue les cellules sensibles mais non résistantes. Sinon, utilisez le tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler les cellules EGFP⁺ au moment de la première division.
27. À partir de maintenant, maintenez les cellules avec une surveillance quotidienne de la confluence et effectuez des changements de milieu complets quotidiennement.
28. Lorsque la confluence est atteinte, préparer un ou plusieurs puits d’une plaque fraîche à 6 puits revêtus (avec 1 mL de matrice de membrane basale solubilisée diluée ; voir les étapes 1.3-1.5) et récolter les cellules comme décrit aux étapes 1.6-1.15.
    REMARQUE : Si aucun agent de sélection n’est inclus, trier les cellules par cytométrie en flux à ce stade. Assurez-vous que les cellules sont triées avec une buse suffisamment large et à basse pression pour minimiser les contraintes, ainsi que 10 μM Y-27632 sont inclus à chaque étape du processus de tri.
29. Plaquez les cellules à une densité finale de 200 000 cellules/cm².
30. Maintenir la surveillance quotidienne et effectuer les changements de milieu quotidiennement.
    REMARQUE : Lorsque les cellules atteignent à nouveau la confluence, elles sont maintenant prêtes à l’emploi. Alternativement, un stock peut maintenant être gelé pour une utilisation future comme suit.
31. Divisez, récoltez et comptez les cellules comme décrit aux étapes 1.6 à 1.15.
32. Pré-étiqueter un ensemble de cryoflacons avec les informations pertinentes (par exemple, passage, EGFP%, ligne).
33. Remettre en suspension à 400 000 cellules/mL dans un milieu + 10 % de DMSO.
    REMARQUE : Le DMSO est toxique pour les cellules lorsqu’il n’est pas congelé, alors minimisez le temps passé à température ambiante en présence de DMSO.
34. Ajouter 1 mL (400 000 cellules) du mélange de l’étape 1.33 par cryoflacon et placer dans un récipient de congélation des cellules.
35. Transférez le récipient dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit.
36. Le lendemain, transférez les cellules dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

2. Injection de cellules marquées dans l’organoïde cérébral

REMARQUE : Pour cet article, les organoïdes cérébraux ont été produits à l’aide d’un kit commercial conformément aux instructions du fabricant. Il peut être remplacé par l’organoïde cérébral d’intérêt. Les matériaux utilisés dans cette partie du protocole doivent être pré-refroidis pour éviter la gélification de la matrice de la membrane basale solubilisée à une température supérieure à 4 °C.

1. Placez les seringues à insuline, les embouts et les tubes qui seront en contact avec la matrice de la membrane basale solubilisée à −20 °C pour les laisser refroidir.
2. Décongeler une aliquote de taille appropriée de matrice de membrane basale solubilisée sur de la glace en fonction du nombre d’injections qui seront effectuées (~2 μL/injection). Cela prend environ 30 min.
3. Pendant que l’aliquote décongèle, divisez, récoltez et comptez les cellules comme décrit aux étapes 1.6 à 1.15.
4. Calculez les volumes nécessaires par injection. Si vous faites plusieurs injections, placez le volume total de cellules dans un tube de 1,5 ml et ajoutez jusqu’à 1 ml de DMEM/F12.
   REMARQUE : Un volume qui permet quelques injections supplémentaires doit être utilisé pour tenir compte des pertes/erreurs de pipetage.
5. Placez les cellules dans de la glace pendant que les prochaines étapes sont préparées.
6. Après décongélation, diluer la matrice solubilisée de la membrane basale jusqu’à une concentration finale de 3 mg/mL dans du DMEM/F12 glacé.
7. Retirez la suspension unicellulaire de la glace et faites-la tourner à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
   REMARQUE : Si une centrifugeuse réfrigérée n’est pas disponible, l’essorage à température ambiante semble généralement toléré.
8. Retirez délicatement le milieu complètement sans perturber la pastille cellulaire. Remettre la pastille cellulaire en suspension par pipetage doux dans la matrice de membrane basale solubilisée diluée (3 mg/mL) pour obtenir un volume final de 2 μL par injection à réaliser, et la remettre immédiatement sur la glace jusqu’à utilisation.
   REMARQUE : La remise en suspension des cellules doit être effectuée lentement et avec des pointes pré-réfrigérées pour éviter la formation de bulles et la gélification.
9. Transférez la ou les seringues préréfrigérées du congélateur à -20 °C dans un seau à glace. Gardez-les là jusqu’à utilisation.
10. Retirez la plaque contenant les organoïdes cérébraux de l’incubateur. Utilisez une pointe à alésage large pour transférer l’organoïde à injecter dans une boîte de 35 mm. Retirez tout le milieu possible sans endommager l’organoïde pour le stabiliser et faciliter l’injection.
    REMARQUE : Il est important d’utiliser des pointes à large diamètre pour éviter de détruire l’organoïde. S’ils ne sont pas disponibles, coupez l’extrémité d’une pointe P1 000 ordinaire avec des ciseaux stériles.
11. Placez la boîte de 35 mm contenant l’organoïde sous un microscope à dissection pour aider à guider et faciliter l’injection.
    REMARQUE : Si un microscope de dissection n’est pas disponible dans une zone stérile, il est possible d’effectuer l’injection sans microscope, bien qu’avec un contrôle quelque peu réduit. Une autre alternative est l’utilisation d’une boucle de grossissement ou de lunettes.
12. Une fois que le ou les organoïdes sont prêts à être injectés, remettre doucement les cellules en suspension avec une pointe de pipette P20 réfrigérée et déplacer 2 μL (contenant le nombre souhaité de cellules à injecter) sur une lame de verre stérile pré-refroidie.
    REMARQUE : Pour les injections multiples, des volumes supplémentaires de 2 μL peuvent être ajoutés à travers la lame de verre. Gardez-le sur de la glace et veillez à éviter l’évaporation.
13. Prenez une seringue à insuline préréfrigérée dans la glace et aspirez lentement les 2 μL de suspension cellulaire avec le biseau de l’aiguille vers le bas pour permettre à toutes les cellules/milieux d’être absorbés.
    REMARQUE : Assurez-vous d’aller extrêmement lentement pour éviter d’aspirer de l’air.
14. Ouvrez le couvercle de la boîte contenant l’organoïde et concentrez le microscope dessus. Tenez le plat d’une main. Placez le biseau de l’aiguille vers le haut et, de l’autre main, injectez lentement les cellules dans la surface de l’organoïde.
    REMARQUE : Il est important d’injecter lentement pour éviter d’endommager les tissus.
15. Après l’injection, remettez le couvercle dans le plat et laissez reposer l’organoïde injecté pendant 1 à 2 minutes.
    REMARQUE : Cela permet à la matrice de la membrane basale solubilisée diluée de se gélifier, maintenant les cellules en place. Si le milieu est ajouté trop tôt, il peut emporter les cellules situées à la surface.
16. Ajouter délicatement 500 μL de milieu organoïde et transférer l’organoïde avec une pointe à large diamètre dans un puits d’une plaque de 24 puits. Incuber l’organoïde à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit. Effectuez des changements de milieu complets tous les deux jours.
    REMARQUE : Il est important d’inclure un organoïde témoin négatif (injection fictive), qui sera utilisé pour les ajustements d’imagerie. Pour ce faire, injecter un organoïde comme décrit précédemment avec une matrice de membrane basale solubilisée diluée (3 mg/mL) pour obtenir un volume final de 2 μL sans cellules.

3. Suivi des greffons par imagerie par fluorescence de cellules vivantes

REMARQUE : Utilisez un microscope à fluorescence qui peut exciter le fluorophore d’intérêt et qui dispose du jeu de filtres nécessaire pour détecter sa fluorescence. Comme mentionné précédemment, les NPC utilisés ici étaient EGFP⁺, avec un pic d’excitation de 488 nm et un pic d’émission de ~510 nm.

1. Chargez un organoïde témoin négatif (non injecté ou injecté fictif) et réglez l’intensité d’éclairage et le temps d’exposition de manière à ce que l’autofluorescence soit minimale. Pour l’instrument utilisé ici, l’intensité d’éclairage a été réglée entre 1 et 2 et le temps d’exposition entre 80 ms et 100 ms.
   REMARQUE : Comme de nombreuses longueurs d’onde d’excitation (en particulier les longueurs d’onde inférieures) peuvent être toxiques pour les cellules, il est recommandé de maintenir l’intensité faible et d’éviter de chercher trop longtemps pour éviter d’endommager l’organoïde.
2. Chargez l’organoïde témoin positif et augmentez le temps d’exposition si nécessaire pour vous assurer que les cellules marquées sont clairement visibles. Repositionnez l’organoïde avec une pointe de pipette à large diamètre pour trouver le site d’injection (région EGFP⁺ ).
3. Retirez complètement le milieu de l’organoïde de contrôle négatif. Chargez l’organoïde de contrôle négatif et imagez-le avec les paramètres sélectionnés (pour l’instrument utilisé ici, l’intensité d’éclairage a été réglée entre 1 et 2 et le temps d’exposition entre 80 ms et 100 ms). Une fois l’imagerie terminée, ajoutez immédiatement un milieu frais pour éviter que l’organoïde ne se dessèche.
   REMARQUE : L’élimination du support est essentielle pour obtenir une bonne image car elle fixe la hauteur et l’orientation des organoïdes, qui flottent et bougent constamment, empêchant une imagerie de haute qualité.
4. Répétez le retrait du milieu/l’imagerie avec chacun des organoïdes de test.
5. Remettez les organoïdes à l’incubation normale ou aux changements de milieu (comme à l’étape 2.16) et répétez l’imagerie aux intervalles souhaités. Ici, les organoïdes ont été imagés à la semaine 1, à la semaine 9 et à la semaine 16 après l’injection pour suivre et tester la survie, la prolifération, la différenciation et la migration des NPC EGFP⁺ injectés.

4. Histologie et immunofluorescence

1. À la fin, transférez l’organoïde dans une cassette d’histologie étiquetée avec l’ID de l’organoïde et d’autres identifiants nécessaires.
2. Remplissez la cassette avec 10% de formol et fermez-la. Conservez-le à température ambiante pendant 24 h.
3. Transférer la cassette fermée avec l’organoïde dans un processus tissulaire et régler le protocole suivant : éthanol 70 % 10 min, éthanol 80 % 20 min, éthanol 95 % 30 min, éthanol 100 % 30 min, éthanol 100 % 40 min, éthanol 100 % 50 min, toluène 30 min, toluène 40 min, toluène 50 min, paraffine 25 min à 59 °C, paraffine 35 min à 59 °C, paraffine 40 min à 59 °C, paraffine 50 min à 59 °C.
   REMARQUE : Les étapes ci-dessus sont effectuées sous vide à température ambiante, sauf indication contraire. Ce protocole remplace l’eau par des gradients d’alcool allant jusqu’à 100%. L’étape intermédiaire avec le toluène est une transition entre l’alcool et la paraffine, car les deux y sont solubles. ATTENTION : Le toluène et la paraffine sont considérés comme des matières dangereuses car ils peuvent être des liquides hautement inflammables et peuvent causer des dommages par inhalation ou contact avec la peau ou les yeux. Assurez-vous de les ranger hermétiquement fermés dans un espace sécurisé. Portez un équipement de protection individuelle approprié lorsque vous les manipulez. Éliminez les déchets conformément aux réglementations locales en matière de risques chimiques.
4. Transférez la cassette fermée avec l’organoïde dans un bain de paraffine dans la station d’enrobage.
5. Sortez la cassette du bain, ouvrez-la et transférez l’organoïde dans un moule à base en acier. Placez le moule sous le distributeur de paraffine et couvrez-le complètement de paraffine.
6. Placez la cassette vide sur le dessus du moule de base en acier. Ici, ajoutez plus de paraffine sur le dessus de la cassette.
7. Transférez le moule de base en acier avec la cassette sur le dessus dans de la glace et laissez refroidir pendant 5 min. Retirez le moule en acier et gardez la cassette avec l’organoïde intégré dans un bloc de paraffine.
8. Transférez la cassette dans un microtome pour couper des sections. Coupez les sections comme vous le souhaitez.
   NOTE : Ici, des sections de 15 μm d’épaisseur ont été réalisées dans tout l’organoïde.
9. Déposez chaque section sur la surface d’un bain-marie réglé à 45 °C et prenez-la sur une lame de microscope en verre.
10. Laissez sécher les lames dans un incubateur à 42 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : Les lames peuvent maintenant être stockées à température ambiante jusqu’au moment de la coloration.
11. Placez la lame dans un bocal de coloration pour lames Coplin rempli de toluène pendant 2 min. Répétez cette étape une fois de plus.
    ATTENTION : Le toluène est considéré comme une matière dangereuse car il peut être un liquide hautement inflammable et peut causer des dommages par inhalation ou contact avec la peau ou les yeux. Assurez-vous de le ranger hermétiquement fermé dans un espace sécurisé. Portez un équipement de protection individuelle approprié lorsque vous le manipulez. Éliminez les déchets conformément aux réglementations locales en matière de risques chimiques.
12. Transférer dans un bocal de coloration en verre Coplin rempli d’EtOH 100% pendant 2 min. Répétez cette étape une fois de plus.
13. Transférer dans un bocal de coloration en verre rempli d’eau distillée pendant 2 min. Répétez cette étape une fois de plus.
14. Pour le prélèvement de l’antigène, préparer un tampon de citrate (10 mM d’acide citrique, 0,05 % Tween 20, pH 6,0).
    REMARQUE : Le tampon de citrate peut être conservé à température ambiante jusqu’à 3 mois ou à 4 °C pour un stockage plus long.
15. Réglez un bain-marie entre 95 °C et 100 °C.
    ATTENTION : Ce bain-marie peut provoquer des brûlures si l’on ne fait pas attention. Prenez toutes les précautions nécessaires pour éviter tout contact direct avec le bain ou ses composants.
16. Dans le bain-marie, faites flotter un récipient en plastique pouvant contenir les toboggans à l’intérieur. Assurez-vous que le plastique ne touche pas le fond du bain (en supposant qu’il s’agit d’un bain chauffant par le bas) pour éviter de fondre. Versez le tampon de citrate à l’intérieur du récipient en plastique et laissez-le atteindre 95-100 °C.
17. Une fois que le tampon atteint la température souhaitée, placez les lames à l’intérieur du tampon et couvrez le récipient sans serrer avec un couvercle. Laissez les lames à l’intérieur du récipient dans le bain-marie pendant 30-40 min.
18. Retirez le récipient en plastique du bain-marie et laissez-le refroidir à température ambiante pendant 20 minutes de plus.
19. Lavez les lames pendant 3 x 2 min avec du PBS. Retirez le PBS avec un mouchoir en papier sans toucher l’échantillon ni trop le sécher.
20. Préparez le tampon de perméabilisation (90 ml de PBS + 0,1 % de Tween-20) et remplissez-en un pot de coloration pour lames de verre. Immerger les lames dans le tampon de perméabilisation, et incuber pendant 10 min.
21. Lavez les lames pendant 3 x 2 min avec du PBS.
22. Préparez suffisamment de mélange colorant pour couvrir chaque échantillon (~25 μL).
    REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les anticorps et les concentrations finales utilisées ici.
23. Ajouter 25 μL de mélange colorant pour couvrir chaque tranche d’organoïde. Incuber à température ambiante pendant 1 h ou toute la nuit à 4 °C dans l’obscurité.
    REMARQUE : Assurez-vous que les échantillons restent à une humidité élevée pour éviter l’évaporation du mélange de coloration. Si vous n’avez pas de récipient pour garder les lames humides, mettez-les dans une boîte avec des mouchoirs humides dans le coin.
24. Lavez les lames pendant 3 x 2 min avec du PBS.
25. Rincez une fois à l’eau distillée à l’intérieur d’un bocal de coloration en verre pour éliminer le sel.
26. Ajouter 10 μL de produit de montage liquide + 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à chacun des échantillons.
    REMARQUE : Les lames peuvent être scellées si une deuxième série de coloration n’est pas effectuée. Ici, les lames n’ont pas été recouvertes pour permettre l’accès à la trempe ou à la recoloration, car le retrait de la lamelle peut endommager les tissus.
27. Imagez les lames à l’aide du microscope à fluorescence sélectionné.
    REMARQUE : Assurez-vous d’avoir des contrôles positifs et négatifs pour chaque anticorps afin de permettre le réglage correct des intensités et des temps d’exposition (pour l’instrument utilisé ici, l’intensité d’éclairage a été réglée entre 5 et 6 et le temps d’exposition entre 2 000 ms et 3 000 ms), bien que cela puisse varier en fonction de l’anticorps. De plus, assurez-vous que le microscope dispose de détecteurs adéquats pour chaque canal utilisé. Sachez que les échantillons n’étant pas couverts, ils doivent être placés face vers le haut lors de l’imagerie.
28. Après l’imagerie, préparer un nouveau tampon de trempe 2x (9% H₂O₂ + 50 mM NaOH dans PBS).
    REMARQUE : La solution de trempe doit être préparée fraîche immédiatement avant de l’utiliser. La réaction est sensible à l’activité du H₂O₂, qui va diminuer avec le temps. ATTENTION : H₂O₂ est irritant et NaOH est caustique. Ceux-ci doivent être traités avec un équipement de sécurité approprié et tout contact avec la peau doit être évité. Assurez-vous qu’ils sont éliminés conformément aux politiques locales de sécurité chimique.
29. Remplissez le pot de coloration des lames Coplin en verre à moitié avec 2x tampon de trempe (45 ml), ajoutez 45 ml de PBS et mettez les lames à l’intérieur. Incuber toute la nuit à 4 °C.
30. Vérifier par microscopie à fluorescence que les fluorophores ont été efficacement éteints.
31. Répétez la coloration et l’imagerie comme ci-dessus.
    REMARQUE : La trempe et la recoloration peuvent être répétées pour des cycles supplémentaires si nécessaire, bien que le risque de dommages augmente à chaque cycle supplémentaire.

5. Enregistrement des images

1. Ouvrez FIDJI.
2. Créez un dossier avec les images DAPI du tour 1 et du tour 2. Changez les noms pour clarifier lequel est lequel, si nécessaire.
3. Créez un dossier vide pour la sortie de l’enregistrement de l’image.
4. Cliquez sur Plugins | Inscription | Enregistrer des tranches de pile virtuelles.
5. Sous Répertoire source, sélectionnez le dossier contenant les images DAPI de chaque tour.
6. Sous Répertoire de sortie, sélectionnez le dossier créé pour la sortie d’enregistrement.
7. Définissez le modèle d’extraction de caractéristiques sur Rigide et le menu déroulant Modèle d’enregistrement sur Rigide - translation + rotation pour corriger l’alignement, permettant uniquement à l’image d’être déplacée et tournée pour l’alignement plutôt que d’être déformée.
   REMARQUE : Si une déformation est attendue, le modèle d’extraction de caractéristiques et le modèle d’alignement peuvent être ajustés sur Affine ou d’autres modèles selon les besoins, bien que cela puisse entraîner des transformations indésirables. Parfois, une tranche peut être endommagée entre les tours, ce qui peut empêcher un enregistrement réussi.
8. Cochez la case Enregistrer les transformations pour enregistrer les paramètres de transformation, ce qui permet de les appliquer aux autres canaux.
9. Cliquez sur OK.
10. Sélectionnez l’emplacement d’enregistrement du fichier de transformation (par défaut le répertoire d’entrée), puis cliquez sur Ouvrir.
11. Sélectionnez l’image DAPI qui servira de référence pour les transformations. L’image DAPI de chacun des autres tours sera alignée sur celle-ci.
    REMARQUE : Une fois terminé, les images enregistrées apparaîtront sous forme de pile (et dans le dossier de sortie).
12. Utilisez la barre de défilement en bas pour basculer d’une image à l’autre afin de vérifier que le recalage des images a réussi (les noyaux sont au même endroit dans les deux images, du moins pour les zones qui se chevauchent).
13. Vérifiez qu’un fichier .xml a été créé pour chaque tour des images d’entrée.
    REMARQUE : Ceux-ci contiennent les paramètres de traduction nécessaires pour les fichiers de ce tour.
14. Faites un dossier contenant toutes les images à enregistrer (chaque canal de chaque tour). Notez l’ordre des fichiers.
15. Créez un dossier pour les paramètres de transformation et faites une copie du fichier .xml pour chaque tour par canal à enregistrer. Vérifiez que l’ordre des fichiers (par nom) est le même entre les images à enregistrer et les copies des paramètres de transformation, car l’étape suivante passera en revue et transformera chaque image dans l’ordre des fichiers de paramètres de transformation.
16. Cliquez sur Plugins | Transformer | Transformez des tranches de pile virtuelle.
17. Sous Répertoire source, sélectionnez le dossier contenant les images à enregistrer.
18. Sous Répertoire de sortie, sélectionnez le dossier créé pour la sortie d’enregistrement.
19. Sous Répertoire des transformations, sélectionnez le dossier contenant les fichiers .xml avec une copie par fichier image à transformer. Encore une fois, assurez-vous que l’ordre correspond aux fichiers (c’est-à-dire une copie du .xml du tour 1 pour chaque canal du tour 1, une copie du .xml du tour 2 pour chaque canal du tour 2, etc.).
20. Cliquez sur OK.
    REMARQUE : Une fois terminé, les images enregistrées de ce tour apparaîtront sous forme de pile (et dans le dossier de sortie).
21. Utilisez la barre coulissante en bas pour basculer d’avant en arrière entre les canaux. Vérifiez que tous les canaux ont été transformés de la même manière. Si ce n’est pas le cas, cela est probablement dû à un fichier .xml incorrect dans le répertoire transforms ; Dans ce cas, corrigez le fichier et répétez.
    REMARQUE : La plage de luminosité affichée sera basée sur un canal, mais cela n’affecte pas les images enregistrées réelles, juste l’affichage.
22. Observez que les images enregistrées sont toutes alignées avec succès sur les tours et prêtes pour les superpositions/analyses en aval.
    REMARQUE : Il existe des moyens programmatiques plus efficaces d’effectuer l’enregistrement pour de grands lots. La méthode présentée ici est simple et ne nécessite pas de programmation.

Résultats

Pour valider l’identité de l’organoïde cérébral, des coupes histologiques d’un organoïde cérébral mature (âgé de 2 mois) ont été colorées pour PAX6 (un marqueur des NPC dorsaux²³) et SATB2 (un marqueur des neurones matures, postmitotiques de la couche supérieure²⁴). Comme prévu, les cellules PAX6⁺ étaient présentes à l’intérieur de l’organoïde, et les cellules SATB2⁺ étaient présentes dans les couches supérieures (Figure 2). Ces résultats soutiennent que les organoïdes cérébraux utilisés étaient bien des cerveaux antérieurs dorsaux comme spécifié dans le kit de différenciation. Pour établir la dose-dépendance du système de transplantation d’organoïdes cérébraux, des organoïdes cérébraux âgés de 2 mois ont été injectés avec un nombre croissant de NPC dérivés d’iPSC EGFP⁺ . Une dépendance claire de la dose de fluorescence GFP sur le nombre de cellules d’entrée était présente, avec une détection cohérente des patchs cellulaires EGFP⁺ à 10 000 cellules et plus (Figure 3). La persistance et la migration des NPC transplantés ont ensuite été évaluées en suivant les organoïdes transplantés au fil du temps. Pour cela, 50 000 NPC EGFP⁺ dérivés d’iPSC ont été transplantés dans des organoïdes cérébraux âgés de 2 à 3 mois générés à partir de la même lignée d’iPSC. Les organoïdes injectés et les témoins ont été imagés pour la positivité de l’EGFP à des moments indiqués au cours des 3-4 mois suivants. Dans cette série de transplantations, nous avons observé la persistance du site d’injection tout au long de la période de suivi de 4 mois (Figure 4A). Des patchs de cellules EGFP⁺ supplémentaires sont apparus 9 jours après la transplantation et ont persisté jusqu’au point final de l’étude (3-4 mois selon l’organoïde), indiquant la migration des cellules et l’intégration à leurs nouveaux sites (Figure 4A). À un grossissement plus élevé, une morphologie neurale claire était observable avec de longues projections dans l’organoïde (Figure 4B), confirmant l’intégration des cellules injectées.

Pour déterminer l’état de différenciation des cellules injectées tard après l’injection, l’organoïde suivi de 4 mois et son témoin ont été fixés, enrobés de paraffine, coupés en tranches de 15 m d’épaisseur et montés sur des lames de verre. Les tranches ont ensuite été traitées et colorées soit en un seul cycle de coloration fluorescente (EGFP, TUJ1, NESTIN), soit pendant deux cycles de coloration consécutifs pour ajouter des marqueurs supplémentaires (MAP2, GFAP). La coloration initiale en un seul tour a confirmé la présence de cellules EGFP⁺ au site d’injection, y compris un mélange de cellules conservant le statut de NPC (NESTIN⁺TUJ1⁻) et de cellules qui s’étaient différenciées vers un destin neural (^NESTIN−TUJ1⁺) (Figure 5). Pour les organoïdes témoins et injectés, très peu de NPC NESTIN⁺ ont été observés (la plupart, mais pas tous, étant des NPC transplantés EGFP⁺ au site d’injection), avec une majorité de neurones immatures-matures ^TUJ1+ (Figure 5). La coloration à deux rondes a donné plus de détails, révélant des neurones matures (^NESTIN−TUJ1⁺MAP2^+GFAP−) autour de la majeure partie de la région externe de l’organoïde, avec des zones de neurones immatures (^NESTIN−TUJ1⁺MAP2^−GFAP−) vers le milieu (Figure 6A,B). Des astrocytes (NESTIN⁻TUJ1⁻MAP2⁻GFAP⁺) étaient présents dans les organoïdes injectés et témoins et étaient intercalés sur les bords extérieurs (Figure 6A,B). La coupe pour laquelle la coloration à deux tours a été réalisée dans l’organoïde injecté a montré une petite colonie satellite de cellules EGFP⁺ loin du site d’injection qui avait adopté le phénotype des neurones matures (Figure 6B,C). Certains d’entre eux semblaient être à proximité d’astrocytes ; cependant, il n’y avait pas de cellules EGFP⁺ avec un chevauchement complet de la coloration GFAP, ce qui suggère qu’elles étaient adjacentes plutôt que de générer les astrocytes eux-mêmes (Figure 6B,C).

Figure 1 : Modèle de transplantation de cellules marquées dans des organoïdes cérébraux. Vue d’ensemble schématique de la génération de cellules marquées par transduction lentivirale, de leur transplantation dans des organoïdes cérébraux et de leur suivi par imagerie de cellules vivantes et immunofluorescence. Abréviation : GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Immunofluorescence de coupes histologiques montrant l’architecture d’organoïdes précoces et tardifs. Un organoïde cérébral âgé de 2 mois a été fixé, enrobé de paraffine, tranché et coloré avec PAX6, SATB2 et DAPI. Une section non colorée a été utilisée pour régler le temps d’exposition et d’intégration afin d’éviter un signal faussement positif de l’autofluorescence. Les cellules PAX6+ étaient présentes à l’intérieur de l’organoïde, tandis que les cellules SATB2+ étaient présentes dans les couches supérieures. Des images de la pile Z ont été prises tous les 4,2 μm sur l’ensemble de la coupe tissulaire de 15 μm. Les sections optiques ont été combinées à l’aide de l’option d’empilement de mise au point dans le logiciel Gen5 avec les options par défaut. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : PAX6 = protéine appariée de la boîte 6 ; SATB2 = protéine spéciale de liaison à la séquence riche en AT 2 ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Greffe dose-dépendante de NPC dans des organoïdes cérébraux. Les organoïdes ont été transplantés avec 0 (contrôle négatif), 1 000, 5 000, 10 000 ou 50 000 NPC dérivés de GFP⁺ iPSC. 1 semaine après la transplantation, les organoïdes ont été imagés sur un Cytation 5 avec un cube filtrant GFP. Le contrôle négatif a été utilisé pour régler le temps d’exposition et d’intégration afin de minimiser l’autofluorescence. Les couleurs plus foncées indiquent une plus grande fluorescence EGFP par rapport au témoin négatif. Barres d’échelle = 100 μm. Ce sont des images 4x de l’ensemble des organoïdes. Après l’imagerie, une soustraction de l’arrière-plan de la boule roulante avec un rayon de pixel de 50 a été effectuée avant l’affichage pour corriger l’intensité de fond variable sur les organoïdes. Les sites d’injection identifiés comme les régions de greffe la plus élevée sont indiqués par une flèche rouge où la greffe était présente. Abréviations : NPC = cellules progénitrices neurales ; GFP = protéine fluorescente verte ; EGFP = GFP améliorée ; iPSC = cellule souche pluripotente induite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Suivi de la croissance, de la migration et de la persistance des cellules transplantées avec l’imagerie de cellules vivantes en fluorescence. (A) Les organoïdes témoins et transplantés (50 000 NPC dérivés d’iPSC GFP⁺) ont été suivis par imagerie de cellules vivantes en fluorescence sur une période de 2 à 4 mois à partir de deux ensembles de transplantation indépendants. Des organoïdes témoins négatifs ont été utilisés pour régler le temps d’exposition et d’intégration afin de minimiser l’autofluorescence à chaque point temporel. Les images EGFP ont été capturées à l’aide d’un cube filtrant GFP sur le Cytation 5 à des moments indiqués après la greffe. Les couleurs plus foncées indiquent une fluorescence EGFP plus élevée par rapport au témoin négatif pour ce point temporel. Une soustraction de l’arrière-plan de la boule roulante avec un rayon de pixel de 50 a été effectuée avant l’affichage pour corriger l’intensité de fond variable entre les organoïdes. Les organoïdes ont été placés à peu près dans la même orientation à chaque point temporel, et les images ont été tournées pour assurer la cohérence de l’affichage et montrer clairement la croissance des cellules transplantées. Les sites d’injection identifiés comme les régions de greffe la plus élevée au point temporel le plus précoce sont indiqués par une flèche rouge. Un exemple d’organoïde témoin négatif est illustré au bas de la figure. (B) Des exemples d’images 20x sont montrées à partir d’organoïdes greffés à la semaine 1 et à la semaine 15 après la transplantation. Le contraste local a été amélioré avant l’affichage à l’aide de FIJI pour assurer la visibilité des neurites. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : NPC = cellules progénitrices neurales ; GFP = protéine fluorescente verte ; EGFP = GFP améliorée ; iPSC = cellule souche pluripotente induite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Immunofluorescence des coupes histologiques révélant la persistance des NPC transplantés au site d’injection ainsi que la migration et la différenciation neurale. Images de fluorescence monocanal provenant d’organoïdes (A) non injectés et (B) transplantés. L’image superposée à droite montre les trois canaux d’intérêt (NESTIN, TUJ1 et EGFP), mais n’inclut pas DAPI. Les minimums d’affichage ont été fixés pour exclure uniquement le signal des cellules négatives (déterminées pour l’EGFP à partir de la commande non injectée et pour d’autres canaux en fonction de combinaisons de marqueurs connues). Les maximums d’affichage étaient basés sur le signal le plus élevé observé pour cet anticorps dans n’importe quelle cellule. Les plages d’affichage ont été maintenues constantes entre les organoïdes non injectés et transplantés pour permettre une comparaison directe. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : NPC = cellules progénitrices neurales ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; TUJ1 = tubuline bêta-III ; EGFP = protéine fluorescente verte améliorée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Évaluation de l’état de différenciation et de localisation des cellules greffées par immunofluorescence cyclique des coupes histologiques. Des images de fluorescence monocanal provenant des organoïdes non injectés, (A) assortis selon l’âge et (B) transplantés sont montrées pour la première et la deuxième série de coloration, comme indiqué. Les minimums d’affichage ont été fixés pour exclure uniquement le signal des cellules négatives (déterminées pour l’EGFP à partir de la commande non injectée et pour d’autres canaux en fonction de combinaisons de marqueurs connues). Les maximums d’affichage étaient basés sur le signal le plus élevé observé pour cet anticorps dans n’importe quelle cellule. Les plages d’affichage (et bien sûr, les paramètres d’imagerie) ont été maintenues constantes entre le contrôle et les organoïdes injectés pour permettre une comparaison directe. Barres d’échelle = 100 μm. Une image superposée (à l’exception du DAPI) est affichée pour chaque cycle de coloration pour chaque organoïde à droite. (B) Pour l’organoïde injecté où l’enregistrement d’image a été effectué, toutes les images sont recadrées à la région observée dans les deux cycles de coloration. (B, C) Pour l’organoïde injecté, les régions cellulaires EGFP⁺ sont délimitées en bleu. Un diagramme de la façon dont DAPI est utilisé pour faire correspondre les caractéristiques lors de l’alignement d’images est présenté en (C), suivi d’une fusion globale de l’image enregistrée. Abréviations : DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; TUJ1 = tubuline bêta-III ; EGFP = protéine fluorescente verte améliorée ; MAP2 = protéine 2 associée aux microtubules ; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

	Clone	Fluorophore	Concentration
Anti-NESTIN	10C2	AlexaFluor 594	1 sur 2 000
Anti-TUBB3	TUJ1	AlexaFluor 647	1 sur 2 000
Anti-GFP	FM264G	AlexaFluor 488	1 sur 200
Anti-GFAP	SMI 25	AlexaFluor 594	1 sur 500
Anti-MAP2	SMI 52	AlexaFluor 488	1 sur 1 000
Anti-PAX6	O18-1330	AlexaFluor 647	1 sur 100
Anti-SATB2	EPNCIR130A	AlexaFluor 594	1 sur 500

Tableau 1 : Concentrations d’anticorps pour la coloration. Abréviations : TUBB3 = bêta-tubuline III ; GFP = protéine fluorescente verte ; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale ; MAP2 = protéine 2 associée aux microtubules ; PAX6 = protéine appariée de la boîte 6 ; SATB2 = protéine spéciale de liaison à la séquence riche en AT 2.

Discussion

Compte tenu de l’intérêt considérable pour les approches thérapeutiques cellulaires pour le traitement des lésions du SNC et des troubles neurodégénératifs 1,2,3,4,5,6,7,8, les modèles de la fonction cellulaire dans un contexte de transplantation gagnent en importance. Cet article présente une méthode de transplantation de NPC humains marqués dans des organoïdes cérébraux humains, ainsi que leur suivi des cellules vivantes et leur évaluation des points finaux par histologie et coloration immunofluorescente. Surtout, nous avons montré que les cellules transplantées étaient capables de migration, de différenciation et de persistance à long terme (4 mois) dans le cadre des organoïdes. Une telle persistance à long terme est une augmentation marquée par rapport à la maintenabilité des cultures de tranches de cerveau¹⁷. Ce système est donc approprié pour examiner de nombreux comportements que l’on devrait évaluer dans un cadre thérapeutique potentiel, tels que la survie, la prolifération et la différenciation. En effet, une étude orthogonale a récemment démontré que les NPC transplantés se comportaient de manière similaire dans les organoïdes cérébraux par rapport aux NPC transplantés dans les cerveaux de souris NSG²⁰, confirmant ainsi l’utilité des organoïdes en tant que receveur de greffe. Comme il s’agit d’un système in vitro, il est également facile d’ajouter des cytokines ou des médicaments d’intérêt. Cela pourrait être utilisé pour mieux comprendre les effets d’environnements spécifiques tels que l’inflammation et les immunosuppresseurs sur les cellules transplantées afin d’imiter davantage ce qu’elles pourraient rencontrer dans un cadre thérapeutique. Le protocole d’immunofluorescence cyclique que nous avons démontré (basé sur des recherches antérieures²¹) étend encore la puissance de cette approche, permettant d’évaluer simultanément un large éventail de marqueurs spécifiques à la lignée et, potentiellement, à la maladie dans une seule section, et, ainsi, permettant un suivi précis des cellules transplantées et de leur impact sur le tissu. Bien sûr, d’autres méthodes d’évaluation des paramètres pourraient être utilisées à la place en fonction des objectifs de l’analyse. Par exemple, le nettoyage tissulaire avec reconstruction 3D pourrait être utilisé si la morphologie cellulaire est d’intérêt principal, ou la dissociation suivie de la cytométrie en flux pourrait être utilisée si la quantification de types cellulaires spécifiques est l’objectif final. Nous nous attendons à ce que cette méthode soit facilement extensible à d’autres types de cellules telles que les tumeurs du SNC, permettant potentiellement leur étude dans un contexte microenvironnemental pertinent. De même, les organoïdes utilisés comme receveurs pourraient être échangés contre des organoïdes modèles de maladies 25,26,27, ce qui pourrait permettre de modéliser des approches de transplantation pour ces conditions.

Comme pour tous les modèles, celui présenté ici a aussi ses propres limites. D’une part, les organoïdes dérivés d’iPSC sont immatures sur le plan du développement¹⁹ et présentent donc des différences importantes par rapport au cerveau vieillissant, dans lequel de nombreuses maladies neurodégénératives se manifestent. Les organoïdes cérébraux ne sont pas non plus uniformes dans leur développement¹⁹, ce qui empêche une injection cohérente dans la même niche physiologique exacte. De plus, bien qu’ils contiennent les types de cellules des régions cérébrales pertinentes^18,19, ils manquent des composants endothéliaux, microgliaux et immunitaires, qui sont également importants dans le contexte in vivo ¹⁴. Cela limite l’étude de la façon dont l’hôte réagira à la greffe de cellules. Des techniques sont actuellement mises en ligne pour ajouter des cellules vasculaires²⁸ et microgliales²⁹, ainsi que pour augmenter la consistance et la régionalisation des organoïdes¹⁸, améliorant ainsi le pouvoir de modélisation du système de transplantation d’organoïdes. Ils nécessiteraient toutefois des tests et des optimisations supplémentaires au-delà de ce qui est présenté ici. Bien que ce protocole soit peu coûteux et ne nécessite pas d’équipement spécialisé, il reste un certain nombre de considérations techniques importantes, comme la profondeur d’injection, par exemple. Cela est dû au fait que les organoïdes ne sont pas perfusés et, par conséquent, ont souvent un centre nécrotique s’ils deviennent trop grands¹⁹ et que la lumière ne peut pas pénétrer à travers le noyau de l’organoïde pour le suivi des cellules vivantes. Ainsi, les cellules qui ont été injectées trop profondément et les colonies qui ont migré à l’intérieur peuvent passer inaperçues. Bien que cela puisse être amélioré par l’utilisation de fluorophores de plus grande longueur d’onde avec une meilleure pénétrance tissulaire³⁰, selon la taille de l’organoïde et l’appareil de détection, cela restera probablement une considération. Enfin, comme les organoïdes cérébraux sont en cours de développement, le moment de la transplantation est un autre facteur clé, car l’environnement sera probablement différent en fonction du stade de développement de l’organoïde dans lequel il est injecté. Bien que cela puisse être contrôlé dans une certaine mesure en assurant un âge cohérent des organoïdes au moment de l’injection, c’est sans aucun doute un facteur qui doit être pris en compte.

Ce protocole est peu coûteux, simple, sans animaux et ne nécessite pas d’équipement spécialisé, ce qui rend la modélisation de la transplantation accessible à une plus grande variété de laboratoires. Avec le rythme rapide des progrès à la fois dans les thérapies à base de cellules neurales et les systèmes de modèles organoïdes, nous prévoyons que le protocole de transplantation d’organoïdes présenté ici sera un modèle utile pour une gamme de maladies et d’approches thérapeutiques.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	StemCell Technologies	7920	proteolytic-collagenolytic enzyme mix
Alexa Fluor 488 anti-GFP Antibody	BioLegend	338008
Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52)	BioLegend	801804
Alexa Fluor 594 anti-GFAP Antibody (clone SMI 25)	BioLegend	837510
Alexa Fluor 594 anti-Nestin (clone 10C2)	BioLegend	656804
Alexa Fluor 647 anti-Tubulin β 3 (TUBB3) (clone TUJ1)	BioLegend	801209
Citric Acid Monohydrate	Fisher Chemical	A104-500
Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Biotek	-
Denaturated Ethyl Alcohol (Anhydrous)	ChapTec	-
DMEM F12/Glutamax	Thermo	10565018
Dymethil Sulfoxide (DMSO), Sterile	BioShop	DMS666.100
FIJI 1.53c	-	-
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Gen5	-	-
HistoCore Arcadia H	Leica Biosystems	-
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)	Corning	356231	Phenol Red-free, LDEV-free
MX35 microtome blade	Epredia	3053835
NaOH	Sigma	655104
PBS (-Ca -Mg)	Sigma	D8537
Puromycin Dihydrochloride	Thermo	A1113803
ROCK inhibitor Y-27632	Abcam	ab120129
Simport Scientific Stainless-Steel Base Molds	Fisher Scientific	22-038-209
Simport Scientific UNISETTE Biopsy Processing/Embedding Cassette	Fisher Scientific	36-101-9255
STEMdiff Forebrain Neuron Differentiation Kit	StemCell Technologies	8600
STEMdiff Neural Progenitor Medium	StemCell Technologies	5833
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit	StemCell Technologies	8581
Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome	Thermo Scientific	-
Tissue Prep	Fisher Scientific	T555
Tissue-Tek VIP 6  AI Tissue Processor	Sakura Finetek	-
Toluene (histological)	ChapTec	-
Trypan blue; 0.4% (wt/vol)	Thermo	15250061
Tween 20	BioShop	TWN510.100