In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions radiculaires dorsaux intacts

Résumé

Ce protocole décrit l’exposition chirurgicale du ganglion radiculaire dorsal (DRG) suivi de GCaMP3 (indicateur Ca²⁺ codé génétiquement; Protéine fluorescente verte-calmoduline-protéine M13 3) Imagerie Ca²⁺ des ensembles neuronaux à l’aide de souris Pirt-GCaMP3 tout en appliquant une variété de stimuli à la patte postérieure ipsilatérale.

Résumé

L’imagerie Ca 2+ peut être utilisée comme proxy de l’activité cellulaire, y compris les potentiels d’action et divers mécanismes de signalisation impliquant l’entrée de Ca 2+ dans le cytoplasme ou la libération de réserves intracellulaires de Ca²⁺. L’imagerie Ca²⁺ basée sur Pirt-GCaMP3 des neurones sensoriels primaires du ganglion de la racine dorsale (DRG) chez la souris offre l’avantage de mesurer simultanément un grand nombre de cellules. Jusqu’à 1 800 neurones peuvent être surveillés, ce qui permet d’étudier les réseaux neuronaux et les processus somatosensoriels en tant qu’ensemble dans leur contexte physiologique normal au niveau de la population in vivo. Le grand nombre de neurones surveillés permet de détecter des schémas d’activité qui seraient difficiles à détecter en utilisant d’autres méthodes. Les stimuli peuvent être appliqués à la patte postérieure de la souris, ce qui permet d’étudier les effets directs des stimuli sur l’ensemble neuronal DRG. Le nombre de neurones produisant des transitoires Ca 2+ ainsi que l’amplitude des transitoires Ca²⁺ indiquent une sensibilité à des modalités sensorielles spécifiques. Le diamètre des neurones fournit des preuves de types de fibres activées (mécano non nocif vs fibres nocives de la douleur, fibres Aβ, Aδ et C). Les neurones exprimant des récepteurs spécifiques peuvent être marqués génétiquement avec la tomate td-tomate et des recombinases Cre spécifiques avec Pirt-GCaMP. Par conséquent, l’imagerie Pirt-GCaMP3 Ca²⁺ de DRG fournit un outil et un modèle puissants pour l’analyse de modalités sensorielles spécifiques et de sous-types de neurones agissant comme un ensemble au niveau de la population pour étudier la douleur, les démangeaisons, le toucher et d’autres signaux somatosensoriels.

Introduction

Les neurones sensoriels primaires innervent directement la peau et ramènent l’information somatosensorielle au système nerveux central ^1,2. Les ganglions radiculaires dorsaux (DRG) sont des amas cellulaires de 10 000 à 15 000 neurones sensoriels primaires ^3,4. Les neurones DRG présentent divers modèles d’expression de taille, de myélinisation et de gènes et de récepteurs. Les neurones de plus petit diamètre comprennent les neurones sensibles à la douleur et les neurones de plus grand diamètre répondent généralement à des stimuli mécaniques non douloure....

Protocole

Toutes les procédures décrites ici ont été effectuées conformément à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à San Antonio.

NOTE: Une fois commencé, la chirurgie animale (étape 1) et l’imagerie (étape 2) doivent être complétées de manière continue. L’analyse des données (étape 3) peut être effectuée ultérieurement.

1. Chirurgie et sécurisation de l’animal pour l’imagerie L5 DRG du côté droit

REMARQUE : Des souris mâles et femelles Pirt-GCaMP3 C57BL/6J âgées de 8 se....

Résultats

Figure 4 : Images représentatives des ganglions de la racine dorsale L5 de souris Pirt-GCaMP3. (A,D) Des scans haute résolution à image unique des ganglions de la racine dorsale L5 de souris Pirt-GCaMP3 sont montrés. (B, E) . Projections d’intensité moyenne de 15 images de ganglions DRG de Pi.......

Discussion

La douleur persistante est présente dans un large éventail de troubles, débilitante et/ou réduisant la qualité de vie d’environ 8% des personnes²⁹. Les neurones sensoriels primaires détectent les stimuli nocifs sur la peau, et leur plasticité contribue à la persistance de la douleur⁸. Bien que les neurones puissent être étudiés en culture cellulaire et explants, cela les éloigne de leur contexte physiologique normal. L’exposition chirurgicale du DRG, suivie .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anased Injection (Xylazine)	Covetrus, Akorn	33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC	Cal Zeiss	422642-9900-000
Cotton Tipped Applicators	McKesson	24-106-1S
Curved Hemostat	Fine Science Tools	13007-12
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
DC Temperature Controller Heating Pad	FHC	40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated Forceps	Fine Science Tools	11252-50
FHC DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fluriso (Isoflurane)	MWI Animal Health, Piramal Group	501017
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16221-14
GelFoam	Pfizer	09-0353-01
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	KET-00002R2
Luminescent Green Stage Tape	JSITON/ Amazon	B803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer	Midmark	91305430
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5882
Micro dissecting spring scissors	Fine Science Tools	15023-10
Micro dissecting spring scissors	Roboz	RS-5677
Mini Rectal Thermistor Probe	FHC	40-90-5D-02
Operating scissors	Roboz	RS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice	Johns Hopkins University	N/A	Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometer	Bioseb In vivo Research Instruments	BIO-SMALGO
Stereotaxic frame	Kopf Model 923-B	923-B
td-Tomato C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	7909
Top Plate, 6 in x 10 in	Newport	290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	17769
Zeiss LSM 800 confocal microscope	Cal Zeiss	LSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software	Cal Zeiss	Zen (Blue Edition) 2.6