Établissement, entretien, différenciation, manipulation génétique et transplantation d’organoïdes lacrymaux et humains

Résumé

Ce protocole décrit comment établir, maintenir, modifier génétiquement, différencier, caractériser fonctionnellement et transplanter des organoïdes des glandes lacrymales dérivés de tissus primaires de souris et humains.

Résumé

La glande lacrymale est un organe essentiel pour l’homéostasie de la surface oculaire. En produisant la partie aqueuse du film lacrymal, il protège l’œil du stress de dessiccation et des agressions extérieures. On sait peu de choses sur la (physionomie) de la glande lacrymale en raison du manque de modèles in vitro adéquats. La technologie organoïde s’est révélée être une plate-forme expérimentale utile pour plusieurs organes. Ici, nous partageons un protocole pour établir et maintenir les organoïdes des glandes lacrymales de souris et humaines à partir de biopsies de glandes lacrymales. En modifiant les conditions de culture, nous améliorons la fonctionnalité organoïde de la glande lacrymale. La fonctionnalité organoïde peut être sondée par un test « pleurant », qui consiste à exposer les organoïdes de la glande lacrymale à des neurotransmetteurs sélectionnés pour déclencher la libération de larmes dans leur lumière. Nous expliquons comment imager et quantifier ce phénomène. Pour étudier le rôle des gènes d’intérêt dans l’homéostasie des glandes lacrymales, ceux-ci peuvent être génétiquement modifiés. Nous décrivons en détail comment modifier génétiquement les organoïdes des glandes lacrymales à l’aide d’éditeurs de base, de la conception de l’ARN guide au génotypage des clones organoïdes. Enfin, nous montrons comment sonder le potentiel de régénération des organoïdes des glandes lacrymales humaines par implantation orthotopique chez la souris. Ensemble, cet ensemble complet d’outils fournit des ressources pour utiliser les organoïdes des glandes lacrymales de souris et humaines pour étudier la (physionomie) de la glande lacrymale.

Introduction

La glande lacrymale est l’épithélium glandulaire responsable de la production de la majeure partie de la couche aqueuse du film^{lacrymal 1}. La couche aqueuse du film lacrymal contient non seulement de l’eau pour lubrifier la surface oculaire, mais aussi un large répertoire de composants antimicrobiens qui protègent la surface oculaire contre les infections². Lorsque la glande lacrymale est endommagée ou enflammée, une maladie de l’œil sec se produit, ce qui entraîne une gêne pour les patients et peut éventuellement entraîner une perte de vision³. Au fil des ans, les systèmes modèles pour étudier la glande lacrymale, en particulier la glande humaine, ont été limités ^4,5,6. Cela a contribué à combler un manque de connaissances sur la fonction des glandes lacrymales dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Récemment, des modèles in vitro ont été développés pour étudier la glande lacrymale dans une boîte 7,8,9. Ces organoïdes des glandes lacrymales sont dérivés de cellules souches adultes cultivées comme structures tridimensionnelles dans une matrice extracellulaire complétée par un cocktail de facteurs de croissance qui soutient leurs capacités de régénération in vitro⁷. L’avantage des organoïdes dérivés de cellules souches adultes (ASC) est qu’ils peuvent être maintenus très longtemps tout en récapitulant les caractéristiques des tissus sains. Ce type d’organoïde se compose uniquement de cellules épithéliales, contrairement aux organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (CSPi), qui peuvent également contenir des cellules stromales, par exemple. Contrairement aux organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes (CSP), les organoïdes ASC sont établis directement à partir de tissus adultes et ne nécessitent aucune modification génétique pour être développés. Les organoïdes ASC expriment des caractéristiques adultes¹⁰.

Ce protocole contient une boîte à outils pour dériver des organoïdes de glande lacrymale à partir de tissus primaires de souris et humains. Le protocole décrit comment améliorer davantage la fonctionnalité des organoïdes par un simple retrait du facteur de croissance et comment provoquer les organoïdes à sécréter du liquide lacrymal en effectuant un test de gonflement. Ce protocole comprend en outre une méthode de transfection basée sur l’électroporation pour modifier génétiquement des organoïdes de souris à l’aide d’éditeurs de base dérivés de CRISPR. Contrairement au Cas9 classique, l’utilisation d’éditeurs de bases permet de modifier des bases simples dans le génome sans générer de cassure double brin^11,12. Enfin, la transplantation orthotopique d’organoïdes des glandes lacrymales humaines chez des souris immunodéficientes et l’évaluation histologique ultérieure de la greffe sont décrites. Cette boîte à outils organoïde de la glande lacrymale peut être utilisée dans la recherche sur la régénération et la fonction des glandes lacrymales et pour la modélisation des maladies génétiques et inflammatoires.

Protocole

Les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Académie royale néerlandaise des arts et des sciences (KNAW) sous la licence de projet AVD8010020151. Les organoïdes ont été dérivés du surplus de matériel de souris. Les biopsies des glandes lacrymales humaines ont été collectées à partir des déchets de patients subissant une intervention chirurgicale au Centre médical universitaire d’Utrecht (UMCU) après approbation par le comité d’éthique médicale sous le numéro de protocole 18-740. Le protocole contient plusieurs sections qui sont décrites à la figure 1.

Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole. Cette figure met en évidence les différentes étapes du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

REMARQUE : Toutes les compositions de milieu et de tampon sont décrites dans le tableau supplémentaire 1.

1. Établissement d’organoïdes à partir de glandes lacrymales de souris et humaines

1. Disséquer la glande lacrymale de la souris
   1. Préparez les outils de dissection, y compris les ciseaux, les pinces et les coussinets de dissection. Euthanasier une souris par inhalation O2/_CO2 ¹³.
   2. Placez la souris euthanasiée sur son abdomen sur le coussin de dissection et épinglez ses membres. Mouillez les cheveux situés entre les oreilles de la souris et sur le front en utilisant de l’éthanol à 70%.
   3. À l’aide de ciseaux à dissection, faites une ouverture derrière le crâne entre les oreilles. Étendez cette ouverture sur le front jusqu’au nez. Toujours à l’aide de ciseaux, coupez la peau derrière les oreilles pour générer deux volets.
   4. Tirez fermement les volets vers le nez jusqu’à ce que les glandes lacrymales soient exposées, comme le montre la figure 2A. Épinglez les rabats au tampon de dissection. À l’aide de ciseaux, faites une petite incision dans la membrane située au-dessus de la glande lacrymale pour exposer complètement la glande lacrymale.
   5. À l’aide des forceps, tirez sur la glande lacrymale. Il devrait y avoir une certaine résistance jusqu’à ce que le canal lacrymal principal soit déchiré. Si vous préférez, coupez le canal lacrymal principal directement avec des ciseaux.
   6. Placez la glande lacrymale de la souris dans du PBS de qualité culture tissulaire jusqu’à un traitement ultérieur. Procéder au traitement de la glande lacrymale dans les 2-4 heures pour limiter la mort cellulaire. Si cela prend plus de temps, placez la glande lacrymale de la souris dans le milieu de prélèvement de biopsie (tableau supplémentaire 1).
      REMARQUE: Plusieurs glandes lacrymales peuvent être mises en commun si un grand nombre d’organoïdes sont nécessaires immédiatement.
2. Collecte de biopsies de glandes lacrymales humaines
   1. Avant la chirurgie, préparez 20 ml d’aliquotes de milieu de prélèvement de biopsie (tableau supplémentaire 1) dans un tube de 50 ml et donnez-les au chirurgien avant la chirurgie. Ce milieu peut être conservé à 4 °C pendant plusieurs mois.
   2. Le jour de la chirurgie, laisser le chirurgien prélever un morceau de glande lacrymale (habituellement <1 mm³) et le conserver dans le milieu de prélèvement de biopsie (tableau supplémentaire 1) à 4 °C.
   3. Prélevez la biopsie pour la traiter dès que possible. Idéalement, cela devrait être le même jour dans les 2 heures suivant le prélèvement de biopsie.
3. Dérivation organoïde
   1. Préparez à l’avance les éléments suivants : matrice extracellulaire (MEC) décongelée, souris à température ambiante (RT) ou milieu d’expansion humain (tableau supplémentaire 1), collagénase décongelée, milieu de base (tableau supplémentaire 1), deux scalpels, une boîte de Petri de 10 cm, une crépine de 70 μm montée sur un tube de 15 ml et des plaques de suspension à 12 puits préchauffées à 37 °C pendant 30 min.
   2. Préparer le milieu de digestion en combinant tous les composants indiqués dans le tableau supplémentaire 1. Pré-mouiller les scalpels dans ce milieu pour éviter que des morceaux de tissu ne s’y collent.
   3. Récupérez le tissu de la souris ou de la glande lacrymale humaine du milieu et placez-le dans la boîte de Pétri.
   4. À l’aide des scalpels pré-mouillés, hacher le tissu. Une fois que les morceaux de tissu sont très petits (c.-à-d. <0,5 mm³), placez-les dans le milieu de digestion en les grattant de la boîte de Petri avec le scalpel. Si la biopsie humaine est déjà très petite, placez-la directement dans le milieu digestif sans hacher pour éviter la perte de tissu.
   5. Incuber les morceaux de tissu jusqu’à 15 min dans un bain-marie à 37 °C. Retourner régulièrement le tube de 15 ml pour remettre les morceaux en suspension. Surveillez la dissociation cellulaire au microscope de paillasse afin de ne pas trop digérer le tissu.
   6. Pendant ce temps, rétrécir une pipette Pasteur en plaçant son embout dans une flamme en tournant, et pré-mouiller dans le milieu de base. Pour dissocier efficacement le tissu, assurez-vous que le trou est légèrement plus petit que les plus gros morceaux de tissu restants. Pour faciliter le processus de dissociation, pipetez le mélange toutes les 5 minutes avec la pipette Pasteur rétrécie pré-mouillée.
   7. Lorsque de nombreuses cellules individuelles et de petits amas sont visibles au microscope, arrêtez la dissociation en ajoutant 10 mL du milieu de base. Faire tourner à 400 x g pendant 5 min pour granuler les cellules.
   8. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 mL du milieu de base pour répéter le lavage. Filtrez-le à travers une passoire de 70 μm pour éliminer les gros morceaux de tissu non digérés et les fibres de collagène restantes, ce qui empêcherait une polymérisation adéquate de l’ECM. Faire tourner l’éluat à 400 x g pendant 5 min.
      REMARQUE: Une pastille de globules rouges indique la présence de globules rouges, ce qui n’entrave normalement pas la dérivation organoïde. Cependant, pour certaines applications, telles que la cytométrie en flux, les globules rouges doivent être lysés. Pour cela, incuber les cellules dans 5 mL de tampon de lyse des globules rouges frais à TA pendant 5 min, et granuler les cellules à 400 x g pendant 5 min.
   9. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL d’ECM froide pour une seule glande lacrymale de souris et dans 50 μL d’ECM froide pour une biopsie humaine. Lors de la remise en suspension, veillez à ne pas faire de bulles, car celles-ci affecteraient également la polymérisation et la stabilité de l’ECM.
   10. Ensemencer jusqu’à 100 μL de cellules par puits d’une plaque de suspension de 12 puits. Utilisez un P200 pour faire des gouttelettes de ~20 μL dans le puits. Plus les gouttelettes sont petites, meilleure est la diffusion des facteurs de croissance et des nutriments à travers la matrice.
   11. Placez la plaque à l’envers dans un incubateur humidifié à 37 °C pendant 20-30 min pour permettre à l’ECM de se solidifier.
   12. Une fois l’ECM solidifié, ajouter ~1 mL de souris RT ou de milieu d’expansion humain par puits d’une plaque de 12 puits. Rafraîchir le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que les organoïdes atteignent une taille de 300 μm. Pour cela, aspirez le milieu dans le puits, et ajoutez doucement le milieu d’expansion sur le côté du puits sans toucher les gouttelettes ECM pour ne pas les perturber.
       REMARQUE : La primocine (100 mg/mL; 1:1 000 provenant d’un stock commercial) peut être ajoutée lors de l’isolement en cas de contamination bactérienne. Cependant, comme il ralentit également la croissance organoïde, il est préférable de ne pas l’ajouter ou de le retirer après un ou deux passages.

2. Expansion des organoïdes de la souris et de la glande lacrymale humaine

1. Après ~7 jours pour les organoïdes de souris et ~10 jours pour les organoïdes humains, lorsque les organoïdes atteignent une taille de ~300 μm, retirez le milieu de culture.
2. Remettez en suspension les gouttelettes ECM contenant les organoïdes dans 1 mL de solution de trypsine en pipetant vigoureusement de haut en bas avec un P1 000 jusqu’à ce que les gouttelettes tombent en morceaux. Transférer ce mélange dans un tube de 15 ml et l’incuber brièvement dans un bain-marie à 37 °C.
3. Après 2-3 min, utilisez une pipette Pasteur rétrécie et pré-mouillée pour pipeter la suspension organoïde de haut en bas de 10x-15x. Vérifier l’état de dissociation des organoïdes au microscope de paillasse; De petits amas de ~20 cellules doivent être obtenus. Incuber plus longtemps dans le bain-marie à 37 °C et répéter l’étape de pipetage jusqu’à ce que la dissociation soit satisfaisante.
   REMARQUE: Cette étape peut prendre plus de temps pour les organoïdes humains car ils sont multicouches. Des cellules individuelles seront générées; Cela n’affecte pas la croissance organoïde tant que la majeure partie de la suspension organoïde est constituée de petites touffes.
4. Arrêter la dissociation en ajoutant 10 mL du milieu de base. Ensuite, pelleter les cellules à 400 x g pendant 5 min.
5. Après avoir retiré le surnageant et la MEC qui peuvent se trouver sur les organoïdes (couche transparente ressemblant à de la gelée sans organoïdes), remettre les cellules en suspension dans un volume approprié d’ECM froide avant de les plaquer dans une plaque de suspension, comme indiqué à l’étape 1.3.10.
   REMARQUE: Généralement, les organoïdes lacrymaux de souris sont divisés à un rapport de 1: 5 et les organoïdes humains à un rapport de 1: 3. Cela signifie que, lorsqu’on commence avec des organoïdes contenus dans 100 μL d’ECM, ils doivent être remis en suspension dans 500 μL et 300 μL, respectivement, après la scission.
6. Incuber la plaque à l’envers dans un incubateur à 37 °C jusqu’à la solidification de l’ECM pendant 30 min, et recouvrir les organoïdes avec le milieu d’expansion souris ou humain à TA.

3. Cryoconservation des organoïdes de la souris et de la glande lacrymale humaine

1. Pour cryoconserver les organoïdes, diviser d’abord les organoïdes dans le milieu d’expansion selon les instructions données au point 2.
2. Environ 3-4 jours plus tard, lorsque les organoïdes sont en phase de croissance, retirer le milieu et remettre en suspension 100 μL de l’ECM contenant des organoïdes dans 10 mL de milieu de base froide. Incuber sur la glace pendant 10 minutes pour aider à dissocier l’ECM. Retournez le tube régulièrement pour faciliter ce processus.
3. Enduire les organoïdes à 500 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille organoïde dans 1 mL de milieu de cryoconservation (les restes d’ECM ne nuisent pas à la cryoconservation). Transvaser la suspension organoïde dans un cryovial et immédiatement dans un congélateur à −80 °C.
   REMARQUE : Lors de l’utilisation du milieu de cryoconservation décrit dans le tableau des matériaux, les cryofioles peuvent être conservées indéfiniment dans un congélateur à −80 °C. Si un autre milieu de cryoconservation est utilisé, transférer le cryovial dans un réservoir d’azote liquide après 24 heures pour assurer une conservation optimale.
4. Pour décongeler les organoïdes, récupérez le cryovial du congélateur et transportez-le sur glace sèche au bain-marie à 37 °C. Conserver le cryovial dans l’eau jusqu’à ce que la majeure partie de son contenu soit décongelée. Transférer le contenu dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de milieu de base et faire tourner les cellules à 400 x g pendant 5 min.
5. Plaquer les organoïdes dans 100 μL d’ECM avec le milieu d’expansion, comme décrit aux étapes 2.5 et 2.6.

4. Différencier les organoïdes des glandes lacrymales et évaluer leur fonctionnalité

1. Différenciation organoïde
   1. Pour différencier les organoïdes des glandes lacrymales, divisez d’abord les organoïdes dans le milieu d’expansion conformément aux instructions de la rubrique 2.
   2. Après 2 jours, remplacer le milieu d’expansion par un milieu de différenciation souris ou humain comme décrit à l’étape 1.3.12. Rafraîchir le milieu tous les 2-3 jours pour maintenir les organoïdes de souris pendant 5 jours dans ce milieu et les organoïdes humains pendant 9 jours.
   3. Pour évaluer la différenciation organoïde après 5 jours ou 9 jours dans le milieu de différenciation, prélever 100 μL d’ECM contenant des organoïdes pour extraire l’ARN. Pour ce faire, remettre en suspension les gouttelettes ECM dans 1 mL de milieu contenu dans le puits à l’aide d’un P1 000 et transférer la suspension organoïde dans 3 mL de milieu de base glacé. Enduire les organoïdes à 500 x g pendant 5 min.
   4. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un tampon d’extraction d’ARN. Effectuer l’extraction de l’ARN en aval selon les instructions du kit d’extraction d’ARN. Utiliser l’ARN obtenu, par exemple, pour l’analyse RT-qPCR de l’expression des cellules souches (TP63, KRT5, KRT14) et des marqueurs cellulaires différenciés (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2...) ¹⁴.
      NOTE: Pour obtenir l’analyse d’expression pertinente, mesurer l’expression des marqueurs choisis dans un ou plusieurs échantillons de tissus. Les organoïdes cultivés dans des conditions de différenciation ont tendance à contenir moins d’ARN.
2. Dosage du gonflement fonctionnel
   NOTE: Pour cette partie du protocole, utilisez des organoïdes de glande lacrymale humaine différenciés depuis au moins 7 jours. Le temps minimum requis est de 7 jours pour assurer une expression suffisante du marqueur pour la déchirure fonctionnelle. Chaque puits d’une plaque de 12 puits constitue une condition. Le nombre minimum de conditions est de trois : un contrôle positif, un témoin négatif et une condition de test.
   1. Préparer fraîchement 1 mL de milieu de différenciation humain contenant des composants individuels qui induisent la sécrétion par les organoïdes de la glande lacrymale. Par exemple, ajoutez 100 μM de noradrénaline et 1 μM de forskoline, et mélangez bien.
      REMARQUE: La forskoline sert de contrôle positif qui induit généralement un gonflement maximal.
   2. À l’aide d’un microscope accéléré automatisé à fond clair, définissez les positions à imager dans la plaque, l’intervalle de temps (5 min) et la durée (4 h). Assurez-vous qu’une gouttelette ECM entière est visible à chaque position.
   3. Juste avant de commencer à imager et sans déplacer la plaque du microscope, retirez le milieu de culture des puits qui seront imagés et remplacez-le par le milieu bien remis en suspension préparé à l’étape 4.2.1. Inclure comme témoin négatif un puits avec un milieu de différenciation remplacé par un milieu de différenciation seulement, car un rafraîchissement moyen peut déclencher un gonflement organoïde.
   4. Après 4 heures maximum, le test de gonflement est terminé. Analysez les résultats.
      REMARQUE: Ces étapes sont effectuées avec un microscope EVOS M7000 qui permet l’imagerie accélérée automatisée en fond clair. Pour ce microscope, reportez-vous au manuel détaillé du fabricant pour configurer l’imagerie accélérée. Il convient de noter que tout autre microscope ayant des caractéristiques similaires peut être utilisé.
   5. Pour quantifier le gonflement organoïde, mesurer le diamètre de chaque organoïde individuel à 0 h et 4 h. Ouvrez les images d’une seule gouttelette organoïde à 0 h et 4 h dans ImageJ.
   6. Cliquez sur l’icône Ligne droite dans la barre d’outils et dessinez d’abord le diamètre d’un organoïde à 0 h. Ensuite, utilisez l’outil Mesure dans ImageJ (Analyser > Mesurer) pour mesurer la longueur de cette ligne et, par conséquent, le diamètre organoïde avant gonflement. Répéter le processus sur le même organoïde à 4 h pour obtenir le diamètre organoïde après gonflement.
   7. Mesurer le diamètre organoïde de ~20 organoïdes par condition avant et après le test de gonflement.

5. Construire un plasmide pour assommer Pax6

1. Conception de l’ARNg à l’élimination Pax6 utilisation des éditeurs de base C > T
   REMARQUE: Il existe de nombreux logiciels disponibles pour la conception d’ARNg. Ici, Benchling a été utilisé car cela permet la conception intégrée de l’ARNg, l’annotation et l’alignement des traces de Sanger. Toutes les étapes suivantes peuvent donc également être effectuées à l’aide de logiciels alternatifs.
   1. Démarrez le processus de conception de l’ARNg en visualisant le gène cible dans Benchling en cliquant sur Nouvelle (+) séquence d’ADN > > Importer des séquences d’ADN.
   2. Dans l’onglet Importer à partir d’une base de données, tapez le gène d’intérêt, Pax6, puis appuyez sur Rechercher.
   3. Sélectionnez la dernière version du génome de référence de la souris GRCm38 (mm10, Mus musculus) et appuyez sur Importer.
   4. Sélectionnez l’exon où l’ARNg knock-out peut être conçu en respectant les règles suivantes:
      1. Évitez de mettre un ARNg dans le premier exon codant, car des sites de départ alternatifs dans les exons suivants peuvent être utilisés par la cellule pour contourner le codon stop induit précocement.
      2. Concevoir des ARNg dans les exons qui sont présents dans tous les transcrits alternatifs qui peuvent se produire par épissage de l’ARNm Pax6 . Pour ce faire, visualisez Pax6 dans le navigateur de génomes Ensembl et sélectionnez l’exon utilisé dans tous les relevés de notes.
      3. Pour contourner davantage l’épissage alternatif, ciblez un exon qui a un codon incomplet (une ou deux bases restantes d’un triplet). Ceci est de moindre importance mais donne plus de certitude sur les effets des indels induits. Pour Pax6, l’exon 4 à l’exon 11 sont une bonne cible. En outre, choisissez un exon qui contient des résidus de tryptophane (W), de glutamine (Q) ou d’arginine (R).
         REMARQUE: Les éditeurs de base C > T standard qui utilisent SpCas9 ont une fenêtre d’édition qui s’étend du nucléotide 4 au nucléotide 8 à partir du début de l’ARNg (le plus éloigné du PAM). Les éditeurs de bases C > T peuvent introduire des codons stop sur tous les résidus de tryptophane (W) (TGG à TGA, TAG ou TAA) avec un ARNg sur le brin inverse, sur les résidus de glutamine (Q) (CAG à TAG ou CAA à TAA), et enfin, sur les résidus d’arginine (R) (CGA à TGA) sur le brin avant.
   5. Sélectionnez l’exon + 20 bases en amont et en aval. Cliquez sur le côté droit de l’écran sur le signe cible CRISPR, puis cliquez sur Guides de conception et d’analyse.
   6. Dans le menu nouvellement ouvert, sous l’onglet Type de conception, cochez les Guides pour l’édition de base (Komor et al., 2016). Gardez la longueur du guide à 20 nucléotides, et sous Génome pour la souris, sélectionnez GRCm38 (mm10, Mus musculus).
   7. Après avoir cliqué sur le signe + vert, le logiciel détectera automatiquement toutes les séquences de motifs adjacents protospacer (PAM) et, sur le côté droit de l’écran, créera une liste de tous les ARNg potentiels dans la zone autour de l’exon d’intérêt.
   8. Faites défiler la liste jusqu’au signe du codon d’arrêt (*) dans une boîte rouge, qui signale un ARNg qui peut potentiellement transformer un acide aminé en un codon d’arrêt et, par conséquent, entraîner un KO.
   9. Dans la première colonne à droite de la séquence d’ARNg, pour chaque cible « C » autour de la fenêtre d’édition, les efficacités d’édition prédites in silico sont calculées. Assurez-vous que l’édition C > T qui aboutit au codon d’arrêt a une efficacité d’édition d’au moins ~10.
   10. Cliquez sur la valeur dans la colonne Off-Target pour vérifier à quels loci hors cible l’ARNg pourrait se lier. Évitez de choisir un ARNg qui se lie à des gènes supplémentaires pour augmenter la spécificité. Par exemple, un bon ARNg pour éditer Pax6 avec un éditeur de base C > T cible l’exon 7 et est 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'.
   11. Créez une annotation dans le fichier Benchling en cliquant sur l’icône Annotations en haut à droite de l’écran, suivie de Nouvelle annotation. Nommez l’annotation et assurez-vous que la bonne orientation d’ARNg est sélectionnée dans le menu déroulant Strand .
2. Génération de plasmides d’ARNg
   REMARQUE: Il existe différents vecteurs disponibles pour la livraison d’ARNg dans les organoïdes. Le plasmide suivant a été utilisé comme base pour la construction de l’ARNg: pFYF1320 (Addgene #47511, un cadeau aimable de Keith Joung).
   1. Pour cloner les ARNg dans pFYF1320, implémentez une stratégie de PCR inverse en utilisant l’amorce directe standard: « /5phos / GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Pour concevoir l’amorce inverse, collez le complément inverse de la séquence d’espacement de l’ARNg (vérifiez l’orientation de l’ARNg [+ ou - brin]) devant la partie d’amorce inverse universelle suivante : CGGTGTTTCGTCCTTTCCAAG. Pour cibler l’exon 7 de la souris Pax6 à l’aide de l’éditeur de base C > T, l’amorce inverse est la suivante : TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCAAG. Commandez les deux amorces.
   2. Exécuter une réaction de PCR inverse en utilisant 1 ng de pFYF1320 comme matrice en utilisant une ADN polymérase haute fidélité pendant 35 cycles à une température de recuit de 61 °C.
   3. Exécutez la réaction de PCR sur un gel d’agarose à 1% dans un tampon TAE à 100 V pendant ~45 min pour visualiser le fragment attendu de 2 281 paires de bases (pb). Effectuez un nettoyage de gel à l’aide de la trousse de votre choix.
   4. Configurez la réaction de ligature suivante : 100 ng de produit PCR nettoyé, l’enzyme Dpn1 pour éliminer l’ADN modèle initial du pFYF1320 et la T4 ligase. Incuber le mélange pendant 15 min à 20 °C, 30 min à 37 °C et 20 min à 80 °C.
   5. Transformer le mélange réactionnel en bactéries DH5α chimiquement compétentes et étaler les bactéries sur des plaques de gélose contenant de l’ampicilline¹⁵.
   6. Le lendemain, cueillir et agrandir trois colonies individuelles dans 3 mL de bouillon lysogénique (LB) complété par 50 μg/mL d’ampicilline.
   7. Le lendemain, effectuez une miniprep sur 1 mL de chacune des trois mini-cultures à l’aide d’un kit miniprep, et conservez le reste à 4 °C. Soumettre le plasmide obtenu au séquençage de Sanger avec l’amorce U6_Forward pour s’assurer que l’ARNg est correctement inséré dans le vecteur¹⁶.
   8. Après avoir identifié une seule colonie bactérienne avec le bon plasmide, inoculer 500 μL de la mini-culture correspondante dans 50 mL de LB complétée par de l’ampicilline pour amplifier l’ADN plasmidique pendant la nuit. Effectuez une midi-prep le lendemain de l’utilisation d’un kit midiprep. Ce plasmide sera utilisé pour l’électroporation dans la section 6.

6. Génération de clones Pax6 KO

1. Électroporation organoïde
   1. Commencez par les organoïdes de souris qui ont été divisés au maximum 5 jours auparavant afin qu’ils soient dans un état prolifératif. Utilisez ~300-400 μL de gouttelettes organoïdes par knock-out. Inclure une condition supplémentaire pour la sélection d’un témoin négatif qui sera électroporé sans plasmide.
   2. Effectuez les étapes 2.1-2.4 pour dissocier les organoïdes, mais dissociez les organoïdes plus longtemps afin qu’ils soient des cellules uniques. Jetez le surnageant.
   3. Remettez les cellules en suspension dans 80 μL du tampon d’électroporation.
   4. Dans un tube de 1,5 mL, préparer les plasmides suivants pour un maximum de 20 μL : 2,5 μg de plasmide pFYF1320-gRNA, 2,8 μg de plasmide contenant de la transposase, 7,2 μg de plasmide contenant des transposons résistants à l’hygromycine et 7,5 μg de pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
      REMARQUE: Le plasmide pFYF1320-gRNA code l’ARNg précédemment conçu, qui guide l’éditeur de base vers le locus cible. Le plasmide pCMV_ABEmax_P2A_GFP code l’éditeur de base, ainsi qu’un rapporteur GFP, qui peut être utilisé pour surveiller les cellules qui expriment l’éditeur de base après l’électroporation. Le plasmide contenant la transposase code la transposase, qui colle la cassette de résistance à l’hygromycine fournie par le plasmide contenant un transposon de résistance à l’hygromycine quelque part au hasard dans le génome. Les cellules qui ont incorporé cette cassette dans leur génome deviennent résistantes à l’hygromycine et peuvent être sélectionnées positivement par l’ajout d’hygromycine. Comme la co-incorporation de plusieurs plasmides est très probable, la résistance à l’hygromycine constitue une sélection fonctionnelle à enrichir pour les cellules qui ont été éditées pour Pax6.
   5. Ajouter les plasmides aux cellules, et bien mélanger en pipetant de haut en bas.
   6. Configurez l’électroporateur avec les paramètres suivants pour l’impulsion de pores (tension: 175 V; longueur d’impulsion: 5 ms; intervalle d’impulsion: 50 ms; nombre d’impulsions: 2; taux de désintégration: 10%; polarité: +) et pour l’impulsion de transfert (tension: 20 V; longueur d’impulsion: 50 ms; intervalle d’impulsion: 50 ms; nombre d’impulsions: 5; taux de désintégration: 40%; polarité: +/-).
   7. Placer les cellules avec les plasmides dans une cuvette d’électroporation. Mesurez immédiatement la résistance (Ω), qui doit être comprise entre 0,30 A et 0,55 A, et électroportez immédiatement. Effectuer cette étape rapidement est nécessaire pour éviter que les cellules ne se déposent au fond de la cuvette et réduire l’efficacité de l’électroporation.
   8. Transférer les cellules dans un tube de 1,5 mL et ajouter 400 μL de tampon d’électroporation complété par un inhibiteur de la rho-kinase. Laisser les cellules récupérer à TA pendant 30 min.
   9. Enduire les cellules à 500 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et plaquer les cellules dans 200 μL d’ECM. Après solidification, ajouter le milieu d’expansion de la souris.
   10. Les organoïdes kystiques se développent après 2-3 jours. Surveillez quotidiennement le signal GFP, qui révèle la présence de l’éditeur de base C > T.
2. Sélection organoïde
   1. Après ~3 jours, lorsque les organoïdes ont récupéré, ajouter 100 μg/mL d’hygromycine au milieu d’expansion de la souris pour sélectionner les organoïdes qui ont intégré la cassette de résistance à l’hygromycine. Il est fort probable que les cellules qui absorbent un plasmide en absorbent plusieurs. En sélectionnant des organoïdes résistants à l’hygromycine, les organoïdes édités sur le locus Pax6 sont enrichis.
   2. Lorsque toutes les cellules du contrôle négatif sont mortes et que les organoïdes survivants sont ~ 300 μm, choisissez les organoïdes résistants à l’hygromycine.
3. Prélèvement et génotypage des organoïdes
   1. Préparer des pointes P20 stériles à côté du microscope et des tubes de 1,5 mL contenant 100 μL de solution de trypsine chacun sur de la glace.
   2. Pliez une pointe P20 avec une pince. Observez la plaque contenant les organoïdes survivants sur un microscope de paillasse. Lorsqu’un organoïde survivant est mis au point, retirez le couvercle de la plaque. À l’aide de la pointe P20 pliée et toujours au microscope, aspirez chaque organoïde survivant individuellement et placez chacun d’eux dans un tube séparé contenant une solution de trypsine.
   3. Choisissez jusqu’à 20 clones. Le nombre de clones à choisir dépend du nombre de clones requis pour chaque plan expérimental et de l’efficacité d’édition, qui varie en fonction de chaque ARNg et locus.
   4. Lorsque tous les clones ont été prélevés, placer les tubes de 1,5 ml dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 minutes maximum. Vortex chaque tube régulièrement pour augmenter la vitesse de dissociation, et vérifier les organoïdes sous le microscope de paillasse. Lorsque les organoïdes sont dissociés en petits amas et/ou en cellules individuelles, arrêtez la digestion en ajoutant 1 mL de milieu de base.
   5. Pour chaque clone choisi, conserver ~400 μL pour génotyper dans un tube séparé de 1,5 mL. Faire tourner les ~600 μL laissés à 500 x g pendant 5 min, retirer le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 20 μL d’ECM, les plaquer en une seule gouttelette dans un puits d’une plaque de 24 puits et ajouter le milieu d’expansion de souris sans hygromycine.
   6. Pour génotyper les clones, faites tourner les tubes contenant ~400 μL de suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 50 μL de tampon d’extraction d’ADN pour extraire l’ADN.
   7. Incuber immédiatement les cellules comme suit : 6 min à 60 °C, vortex, et 4 min à 95 °C. Cet ADN peut être conservé jusqu’à 7 jours à -20 °C, mais effectuer la PCR en aval immédiatement est le plus optimal.
   8. Pour amplifier le locus ciblé avec la nucléase, effectuer une PCR sur 2 μL de l’ADN extrait en utilisant des amorces de génotypage adéquates commandées au préalable et une polymérase basse fidélité. Les amorces du génotypage sont AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) et TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). L’amplicon doit démarrer à environ 100 pb du locus édité attendu pour s’assurer qu’il est séquencé efficacement.
   9. Exécutez le produit PCR sur un gel d’agarose pour évaluer l’efficacité de la PCR, comme mentionné à l’étape 5.2.3. Lorsqu’une bande de la bonne taille est détectée, découpez-la du gel pour effectuer une extraction de gel d’ADN à l’aide d’un kit.
   10. Séquencer l’ADN extrait de chaque clone organoïde préalablement choisi avec les amorces de génotypage.
   11. Aligner les séquences obtenues sur le gène Pax6 dans Benchling. Ouvrez la séquence génétique importée de l’étape 4.1. Cliquez sur Alignements sur le côté droit, puis sur Créer un nouvel alignement. Téléchargez les fichiers .ab1 obtenus auprès du fournisseur de séquençage, sélectionnez l’ADN comme type de nucléotide, puis appuyez sur Suivant.
   12. Dans la fenêtre suivante, sélectionnez Multiséquence et le programme d’alignement Auto (MAFFT) avant de cliquer sur Créer un alignement.
   13. Identifier les génotypes qui ont un codon stop prématuré homozygote (tel qu’obtenu avec les éditeurs de base) sur les deux allèles. Conservez les clones organoïdes correspondants pour les développer et cryopservez-les pour une analyse plus approfondie. Idéalement, trois clones organoïdes différents devraient être analysés côte à côte pour contourner les effets potentiels de la nucléase hors cible.

7. Transplantation orthotopique d’organoïdes de glande lacrymale humaine chez des souris NSG

1. Préparation organoïde
   1. Les organoïdes des glandes lacrymales humaines doivent être divisés ~3 jours avant le jour de la transplantation, comme décrit à la rubrique 2. Le jour de la transplantation, assurez-vous que les organoïdes sont en phase proliférative pour augmenter les chances de greffe.
   2. Pour extraire les organoïdes de l’ECM, ajouter de la dispase au milieu de culture pour atteindre une concentration finale de 0,125 U/mL. À l’aide d’un P1 000, remettre soigneusement en suspension les gouttelettes ECM pour les perturber et remettre la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 30 minutes. Un volume de 100 μL d’ECM est suffisant pour injecter ~10 glandes lacrymales.
   3. Remettez les organoïdes en suspension dans 10 mL de milieu basique pour éliminer l’enzyme. Enduire les cellules à 400 x g pendant 5 min.
   4. Resuspendre les cellules (~1 500 000) dans 50 μL de milieu d’expansion humain froid supplémenté avec 5% ECM. Placez la suspension organoïde sur de la glace et procédez immédiatement à la transplantation.
2. Transplantation orthotopique chez la souris
   1. Dans l’animalerie, ayez la suspension organoïde et les aiguilles d’insuline sur de la glace. Aspirer la suspension organoïde dans une aiguille à insuline froide.
   2. Sédatif une souris immunodéficiente NOD scid gamma (NSG) avec 3% d’isoflurane pour initier l’anesthésie. Lorsque la souris est endormie, placez-la rapidement sur le côté avec la glande lacrymale principale (située à mi-chemin entre l’œil et l’oreille) accessible.
   3. Injectez 5 μL de la suspension organoïde directement à travers la peau dans la glande lacrymale. Le volume maximal qu’une glande lacrymale de souris peut contenir est de 5 μL.
   4. Laissez la souris récupérer et surveillez la souris tous les jours pour évaluer la présence de tout inconfort lié à la transplantation, en particulier sur l’œil.
3. Évaluer la greffe
   1. Sacrifier la souris avec l’inhalation d’O 2 / CO₂ après 90 jours selon que la greffe à court terme ou à long terme doit être évaluée¹³.
   2. Disséquer la glande lacrymale comme décrit à la section 1. Fixez-le dans du formol à 4% pendant 24 h à TA.
   3. Placez la glande lacrymale dans une cassette. Déshydrater la glande lacrymale en l’incubant comme suit : 2 h dans de l’éthanol à 70 %, 2 h dans de l’éthanol à 96 %, 1 h dans de l’éthanol à 100 % (2x), 2 h dans du xylène, et une nuit dans de la paraffine liquide à 58 °C au four.
   4. Le lendemain, orientez la glande lacrymale comme vous le souhaitez dans un moule métallique, complétez-la de paraffine liquide et laissez le bloc se solidifier sur une surface froide. Ce processus est mieux effectué avec une machine d’intégration.
   5. Lorsque le bloc de paraffine est solide, coupez le bloc entier en sections de 4-5 μm à l’aide d’un microtome. Conservez toutes les sections (en forme de rubans) dans un environnement sec et sans courant d’air. Les sections peuvent être conservées indéfiniment à température ambiante.
   6. Échantillonnez une section sur 10 couvrant l’ensemble du bloc.
      1. Montez les sections sur une lame comme suit: mettez une goutte d’eau sur la lame, placez la section sur le dessus, laissez-la reposer pendant ~ 2 minutes pour lui permettre de s’étirer sur une plaque chauffante à 42 ° C et retirez doucement l’eau avec du papier.
      2. Placer les lames à sécher pendant la nuit dans un four à 58 °C. Les diapositives peuvent être conservées indéfiniment à RT au-delà de ce stade.
   7. Pour distinguer les cellules humaines des cellules de souris, effectuez une coloration de l’antigène nucléaire humain sur ces sections. Réhydratez les sections en effectuant les lavages suivants : 3 min dans du xylène (2x), 1 min dans de l’éthanol 100% (2x), 1 min dans chacun dans de l’éthanol à 96%, 90% d’éthanol, 80% d’éthanol, 70% d’éthanol, 60% d’éthanol et 25% d’éthanol, et enfin, 1 min dans de l’eau demi (2x).
   8. Incuber les lames pendant 15 min dans un tampon PO (tableau supplémentaire 1). Lavez les lames 3x à l’eau ultrapure.
   9. Effectuer une récupération d’antigène à base de citrate dans l’autoclave :
      1. Placez les lames dans un support à lames résistant à l’autoclave dans un panier rempli de tampon de citrate (tableau supplémentaire 1). Placez le panier dans l’autoclave et exécutez un cycle d’autoclave (pression: 10 PSI; température: 121 °C; durée: 15 min).
      2. Lorsque l’autoclave est dépressurisé, récupérez le panier contenant les lames et placez-le dans un bain-marie RT pour amener les lames à RT.
         REMARQUE : La stratégie de récupération de l’antigène dépend de l’anticorps utilisé. Reportez-vous à la fiche technique du fournisseur pour effectuer le prélèvement d’antigène le plus adéquat.
   10. Placez les lames horizontalement, côté section vers le haut, sur un plateau d’incubation. Ajouter 500 μL de tampon bloquant contenant 1% d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS sur le dessus et incuber pendant 1 h. Retirez la mémoire tampon bloquante.
   11. Préparer la solution d’anticorps en ajoutant 1 μL d’antigène-antigène nucléolaire humain à 500 μL de tampon bloquant par lame à colorer. Ajouter la solution d’anticorps à chaque lame. Incuber pendant la nuit dans un bac d’incubation humidifié à 4 °C.
   12. Le lendemain, lavez les lames 3x dans PBS. Incuber les lames avec un anticorps secondaire anti-souris HRP non dilué pendant 45 min. Lavez les lames 3x dans PBS.
       PRUDENCE. Dans une hotte chimique, préparer le tampon DAB (tableau supplémentaire 1). Incuber les lames avec un tampon DAB pendant 10 min. Jetez tous les déchets dans des contenants de déchets liquides de produits chimiques organiques.
   13. Lavez les lames à l’eau. Incuber les lames pendant 2 min dans de l’hématoxyline pour contre-colorer les noyaux. Lavez les lames à l’eau courante du robinet pendant 10 min.
   14. Déshydratez les lames en les incubant pendant 1 min chacune dans de l’éthanol à 50 %, 60 % d’éthanol, 70 % d’éthanol, 80 % d’éthanol et 90 % d’éthanol, 1 min dans de l’éthanol à 96 % (2x), 1 min dans de l’éthanol à 100 % (2x) et 1 min dans du xylène (2x).
   15. Entourez les glissières d’un support de montage et d’une lamelle de couverture. Après séchage pendant environ 20 min, observez les lames au microscope.
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Résultats

Suite à la dissection de la glande lacrymale de la souris (Figure 2A), la digestion enzymatique et mécanique a généré de petits fragments tissulaires, parmi lesquels on a pu distinguer les acini et les canaux (Figure 2B). Les gros morceaux de tissu restants déstabiliseraient l’ECM, ce qui réduirait la croissance organoïde initiale. La dérivation organoïde de la glande lacrymale de souris a été réussie lorsque des organoïdes kystiques de ~500 μm de diamètre ont été trouvés après ~7 jours, stade auquel les organoïdes étaient prêts à être divisés (Figure 2C). Même si la dérivation organoïde globale est réussie, certains organoïdes peuvent commencer à croître avant de s’arrêter éventuellement. Les organoïdes des glandes lacrymales humaines se sont développés sous forme de kystes en 3-4 jours et ont atteint leur taille adulte en 10-14 jours après l’isolement tissulaire (Figure 2D). Pour les souris et les humains, la dérivation organoïde a parfois échoué, avec peu ou pas d’organoïdes en croissance; Cela était généralement causé par une sur-digestion des tissus. Les organoïdes des glandes lacrymales de souris pouvaient être passés au moins 40x et les organoïdes humains au moins 20x. Le passage a été effectué tous les 7 à 10 jours en moyenne, en fonction de la croissance organoïde.

Figure 2 : Etablissement des organoïdes des glandes lacrymales de souris et humains. (A) Photographies des différentes étapes de la dissection des glandes lacrymales de la souris. La flèche pointe vers la glande lacrymale sous sa membrane protectrice. (B) Images en fond clair de cellules de glandes lacrymales de souris juste après la digestion des tissus, avec des encarts montrant un acinus et un canal. (C) Images en fond clair d’une dérivation organoïde réussie et infructueuse de glande lacrymale de souris. (D) Images en fond clair de la croissance organoïde humaine sur une période de 14 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les organoïdes des glandes lacrymales contiennent une grande proportion de cellules souches lorsqu’ils sont cultivés dans le milieu d’expansion. Pour augmenter leur niveau de différenciation, nous avons mis en place une souris et un milieu de différenciation humain à teneur réduite en facteurs de croissance. Après 5 jours et 7 jours, respectivement, dans le milieu de différenciation, les organoïdes de la souris et de la glande lacrymale humaine sont devenus plus denses (Figure 3A-B). Ce changement morphologique était corrélé à une augmentation des propriétés fonctionnelles. L’application de la forskoline, un activateur cyclique de l’AMP, ou du neurotransmetteur noradrénaline, a entraîné un gonflement organoïde (c.-à-d. sécrétion d’eau apicale) en moins de 3 heures (figure 3C). Lorsque le gonflement a pris plus de 3-4 heures, cela a suggéré que les organoïdes n’étaient pas assez différenciés et / ou n’exprimaient pas de marqueurs fonctionnels, tels que les récepteurs des neurotransmetteurs.

Figure 3 : Différenciation des organoïdes des glandes lacrymales de souris et humains et dosage du gonflement fonctionnel dans les organoïdes humains. (A) Images en fond clair d’organoïdes de glandes lacrymales de souris cultivés en milieu d’expansion pendant 7 jours et en milieu de différenciation pendant 5 jours après 2 jours en milieu d’expansion. (B) Images en fond clair d’organoïdes humains de glandes lacrymales cultivés en milieu d’expansion pendant 11 jours et en milieu de différenciation pendant 9 jours après 2 jours en milieu d’expansion. (C) Images en fond clair d’organoïdes humains différenciés de glandes lacrymales exposés à un milieu de différenciation frais (témoin), à 1 μM de forskoline et à 100 μM de noradrénaline pendant 3 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour éliminer Pax6 dans les organoïdes des glandes lacrymales de souris, un plasmide contenant l’ARNg ciblant Pax6 choisi a été généré par PCR et ligature (Figure 4A). Ce plasmide contenant de l’ARNg a été électroporé avec les plasmides Piggy-Bac (plasmides contenant des transposons résistants à l’hygromycine et contenant des transposases) et l’éditeur de base C > T Cas9 dans les organoïdes des glandes lacrymales de souris dissociés en cellules individuelles. Après 3 jours, lorsque les organoïdes se sont rétablis, ils ont été exposés à l’hygromycine pour sélectionner des clones qui avaient incorporé la cassette de résistance à l’hygromycine. Dans les électroporations réussies, des organoïdes résistants à l’hygromycine se sont développés (Figure 4B). Les clones organoïdes en croissance qui étaient plus grands que ~300 μm ont été choisis, idéalement avant qu’ils ne commencent à se différencier spontanément (Figure 4C). L’ADN a été extrait d’une partie de l’organoïde tout en gardant le reste en culture. L’amplification par PCR du locus Pax6 ciblé par l’ARNg a donné une bande de 367 pb pour chacun des clones choisis (Figure 4D). Après séquençage du locus amplifié, les clones qui étaient homozygotement édités en C > T (n = 1) ont été conservés. D’autre part, les clones qui n’ont pas été édités (n = 4), édités de manière hétérozygone ou mal édités (n = 1) ont été éliminés (Figure 4E). Dans l’ensemble, en utilisant cet ARNg ciblant Pax6, un clone homozygote de glande lacrymale de souris knock-out sur six séquencés a été obtenu. Certains clones ont bien poussé, mais certains clones organoïdes ont été perdus après la cueillette ou ont commencé à se différencier (Figure 4F). Sur les 10 clones organoïdes choisis, 7 ont bien poussé.

Figure 4 : Knock-out de Pax6 médié par l’édition de base dans les organoïdes des glandes lacrymales de souris. (A) Séquençage de Sanger de la trace de pFYF1320 après intégration correcte de l’ARNg ciblant le locus Pax6. (B) Images en fond clair d’organoïdes de glandes lacrymales de souris 5 jours après l’exposition à l’hygromycine après électroporation. Les organoïdes ont été cultivés dans un milieu d’expansion de souris. À gauche, un exemple d’électroporation ratée, sans clone résistant à l’hygromycine. À droite se trouve un exemple d’électroporation réussie, avec plusieurs clones organoïdes résistants à l’hygromycine survivants. (C) Images en fond clair des clones qui devraient être choisis et des clones qui ne devraient pas être choisis. (D) Gel d’agarose montrant l’amplification du locus Pax6 ciblé avec l’ARNg. En vert, la bande de la taille attendue de 367 pb est mise en évidence. E) Trace de séquençage de Sanger de trois clones organoïdes résistants à l’hygromycine. Le clone supérieur n’a pas été modifié. Le clone du milieu est une édition homozygote C > T et, par conséquent, un knock-out homozygote. Le clone inférieur présente deux mutations ponctuelles hétérozygotes et est soit un knock-out hétérozygote, soit un clone mixte et a été mal édité. (F) Images en fond clair des clones organoïdes choisis avec différents niveaux d’excroissance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Enfin, pour effectuer une transplantation orthotopique organoïde de glande lacrymale humaine chez la souris, des organoïdes divisés 3 jours à l’avance (< 100 μm de diamètre) ont été utilisés. La greffe d’organoïdes a été confirmée 1 mois après l’injection des organoïdes dans la glande lacrymale de la souris par coloration pour un marqueur spécifique à l’homme, l’antigène nucléolaire humain (Figure 5). L’absence de coloration ponctuée de toutes les sections de la glande lacrymale de la souris signifiait un manque de greffe organoïde humaine.

Figure 5 : Transplantation d’organoïdes des glandes lacrymales humaines dans la glande lacrymale de la souris. Coloration des glandes lacrymales de souris transplantées pour le marqueur nucléolaire humain afin de surveiller la greffe 1 mois après la transplantation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Composition des milieux et des tampons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Ce protocole décrit l’établissement et l’utilisation d’organoïdes de la glande lacrymale pour les essais fonctionnels, la modélisation des mutations et la transplantation. Lors de l’établissement d’organoïdes de la glande lacrymale de souris et d’humains, la dissociation des tissus est cruciale. Si le tissu n’est pas suffisamment digéré, le rendement organoïde sera faible. Si le tissu est trop digéré, les cellules mourront et ne se développeront pas sous forme d’organoïdes. Chaque tissu doit être digéré avec une enzyme spécifique pendant un temps spécifique pour assurer une excroissance organoïde optimale^14,17,18. La glande lacrymale est un tissu plutôt mou pour lequel une digestion de collagénase de 5 à 10 min combinée à une dissociation mécanique à base de pipetage est suffisante pour isoler de petits morceaux de tissu. Si des cellules uniques doivent être obtenues pour des applications telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire, la dissociation peut être effectuée plus longtemps jusqu’à ce que le stade unicellulaire soit atteint, mais la dissociation doit être arrêtée dès que des cellules uniques sont obtenues pour limiter toute diminution de la viabilité. Comme la dissociation tissulaire est si cruciale, la surdigestion est la raison la plus probable de l’échec de l’établissement organoïde de la glande lacrymale.

L’entretien approprié des organoïdes de la glande lacrymale est important pour leur utilisation. L’entretien à long terme est une caractéristique des organoïdes des glandes lacrymales dérivées de cellules souches adultes, par rapport aux organoïdes induits dérivés de cellules souches pluripotentes ^7,17. Pour assurer l’entretien à long terme, un fractionnement régulier des organoïdes et des changements de milieu doivent être effectués. Sans cela, les organoïdes commencent à se différencier et à développer une diminution du potentiel des cellules souches, ce qui entrave leur maintien à long terme⁷. À cette étape encore, une surdigestion peut tuer les cellules souches et nuire à l’entretien des organoïdes. Pour un entretien régulier, la dissociation organoïde en cellules individuelles n’est pas nécessaire. Cependant, pour générer des lignées organoïdes knock-out clonales, il est essentiel de commencer par des cellules individuelles. Sinon, les organoïdes seront constitués d’une mosaïque de cellules ayant des antécédents génétiques différents, rendant impossible l’analyse de l’effet d’une seule mutation définie. Ici, nous décrivons l’utilisation d’un éditeur de base C > T pour générer des codons stop. Cet éditeur du génome repose sur la présence de codons d’arginine, de glutamine ou de tryptophane dans 12 à 18 bases d’un NGG PAM. Lorsque ces conditions ne sont pas remplies dans la conception d’un ARNg, des éditeurs de base conventionnels Cas9 ou C >T avec des PAM alternatifs peuvent être utilisés ^7,18. Cependant, le Cas9 conventionnel introduit des ruptures double brin qui entraînent des indels lors de la réparation¹¹. Comme les deux allèles peuvent abriter des indels différents, le génotypage des clones nécessite une prudence supplémentaire. La déconvolution des modifications introduites doit être effectuée pour s’assurer que les deux allèles contiennent des indels hors cadre et, par conséquent, que les clones organoïdes sont éliminés pour le gène ciblé¹⁹. L’avantage des éditeurs de bases C > T réside dans le fait qu’ils peuvent être utilisés pour modéliser des mutations ponctuelles qui n’aboutissent pas nécessairement à des codons stop. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour modéliser des mutations spécifiques de Pax6 trouvées chez des patients atteints d’aniridie afin d’étudier leur impact sur la physiologie de la glande lacrymale²⁰.

La glande lacrymale sécrète la partie aqueuse du film^{lacrymal 1}. La sécrétion lacrymale peut être récapitulée dans les organoïdes humains après différenciation médiée par le retrait du facteur de croissance et l’inhibition de NOTCH. Dans ces conditions, les organoïdes subissent une différenciation terminale et ne peuvent plus être maintenus. Pourtant, les organoïdes différenciés des glandes lacrymales peuvent guider le développement de médicaments induisant des déchirures dans le contexte de la sécheresse oculaire, potentiellement dans les cribles à haut débit. Le test de déchirure présenté dans ce protocole est celui qui donne actuellement le plus grand changement de taille organoïde en peu de temps, ce qui le rend plus facile à quantifier dans le contexte d’un dépistage de drogue ^7,9,17.

La thérapie par cellules souches est très prometteuse pour la régénération des glandes lacrymales dans la sécheresse oculaire²¹. Les organoïdes des glandes lacrymales dérivés de cellules souches adultes pourraient être une matière première pour de telles applications. Le protocole présenté ici aboutit à une greffe organoïde de glande lacrymale humaine, principalement sous forme de kystes. Une faible greffe d’organoïdes peut survenir en raison de l’injection d’organoïdes au mauvais endroit. L’entraînement de la procédure d’injection avec un colorant permet le suivi du site d’injection et, en fin de compte, améliore la précision de l’injection. Alternativement, l’épiderme de souris peut être incisé pour avoir un accès direct à la glande lacrymale, comme chez le rat avant²² ans. Cette méthode prend plus de temps mais peut être plus précise. D’autre part, avec le présent protocole, les organoïdes ne se sont pas intégrés fonctionnellement dans la glande lacrymale de la souris. Des résultats similaires ont été observés pour la greffe de glande lacrymale dérivée de l’iPSC²². La méthode de transplantation pourrait être encore améliorée en blessant la glande lacrymale à l’avance, en utilisant un modèle de souris à œil sec, et / ou en injectant les organoïdes sous forme de cellules uniques ou de petits amas de petits touffes. Néanmoins, les organoïdes des glandes lacrymales dérivés de cellules souches adultes et la boîte à outils connexe peuvent constituer la base d’applications futures dans la recherche sur les glandes lacrymales et la médecine régénérative.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes	Eppendorf	EP0030 120.094
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637	CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C
5x green GoTaq Flexi buffer	Promega	M891A	Store at -20 °C
A83-01	Tocris	2939	Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	store at 4 °C
Agar plates containing Ampicillin	Hubrecht Institute
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Autoclave VAPOUR-Line lite	VWR chemicals
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	Store at -20 °C, 50x
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL	BD Bioscience	324825
Benchtop microscope DMI1	Leica
Bovine serum albumine (BSA)	MP biomedicals	160069	Store at 4 °C
BTXpress	BTX	MDS450805
C57BL/6 mice	Hubrecht Institute
Cassettes	Klinipath	410-02S
CellBanker 1	amsbio	11910	Cryopreservation medium, adhere to instructions
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid monohydrate	J.T. Baker	0088	CAS: 5949-29-1
Collagenase I	Sigma Aldrich	C9407	Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C
Conical tubes 15 mL	Greiner Bio-One	5618-8271
Conical tubes 50 mL	Corning	CLS430828-500EA
Coverslips 24 mm x 50 mm	Menzel-Gläzer	BB024050S1
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix	R&D Systems, Bio-Techne	3533-001-02	Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month
DAPT	Sigma Aldrich	D5942	Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x
Disodium hydrogen phosphate anhydrous	VWR chemicals	28026.292	CAS: 7558-79-4
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate	Sigma-Aldrich	71643	CAS:10028-24-7
Dispase	ThermoFisher Scientific	17105-041	Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x
Disposable Scalpel Sterile N° 10	Swann Morton	3033838
DM4000 microscope	Leica
dNTPs 25 mM	Promega	U1420	Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C
Dpn1	New England Biolabs	R0176
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)	Gibco	14190144	1x
Easy strainers 70 µm	Greiner	542170
Electroporation cuvette	Nepagene	EC002S
EnVision+/HRP mouse	Agilent	K400111-2
Ethanol 100%	BOOM	84045206;5000	CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions
Ethanol 70%	BOOM	84010059.5000	CAUTION
Ethanol 96%	BOOM	84050065.5000	CAUTION
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific		Live-imaging brightfield microscrope
FGF10	Peprotech	100-26	Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x
Fiji	NIH, Fiji developers
Formaldehyde solution 4%	Sigma-Aldrich	1.00496	CAS: 50-00-0, CAUTION
Forskolin	Tocris	1099	Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Glutamax	Gibco	35050-061	100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase	Promega	M7805	Store at -20 °C
Haematoxylin	VWR chemicals	10047105	Store at room temperature
HEPES	Gibco	15630-080	Store at 4 °C, 100x
Histocore H and C, Tissue embedding machine	Leica
Hot plate	Meidax
Human nucleolar antigen antibody	Abcam	ab-190710
Hydrochloric acid 5 N	ThermoFisher Scientific	10605882	CAS: 7647-01-0, CAUTION
Hydrogen peroxyde 30%	Chem-lab	CL00.2308.1000	CAS: 7722-84-1, CAUTION
Hygromycin B-gold	InvivoGen	ant-hg	Stock at 100 mg/µL, 1000x
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid			Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo 100%	Mecan	5960501
LB medium	Hubrecht Institute
MgCl2 25 mM	Promega	A351H	Store at -20 °C
Microtome RM2235	Leica
Midiprep DNA isolation kit	ThermoFisher Scientific	K210005
Miniprep DNA isolation kit	ThermoFisher scientific	K210003
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x
NEPA21 electroporator	Nepagene
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636	Store at -20 °C, stock at 1M, 100x
NOD Scid Gamma (NSG) mice	Hubrecht Institute colony
Noggin conditioned medium	U-Protein Express	Custom order	Store at -20 °C
Noradrenaline	Sigma Aldrich	A7257	Store at -20 °C, stock at 100 mM
Oven	Memmert		Set at 58 °C
P20, P200 and P1000 pipettes	Gilson
Paraffin	VWR chemicals	10048502
Pasteur pipettes, glass plugged	ThermoFisher Scientific	1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG	IDT
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC	IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFP	Addgene	112101
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Store at -20 °C
Pertex	Klinipath	AM-08010
pFYF1320	Addgene	47511
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1000X, store at -20 °C
Prostaglandin E2 (PGE2)	Tocris	2296	Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Petri dish, 10 cm	Greiner	633102
Q5 buffer	New England Biolabs	B9027S
Q5 high-fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QuickExtract DNA Extraction Solution	Lucigen	QE09050	Store aliquots at -20 °C
R-spondin 3 conditioned medium	U-Protein Express	Custom order	Store at -20 °C
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG	IDT
Slides	StarFrost	MBB-0302-55A	Adhesive, ground
Sodium azide	Merck	8.22335.1000	CAS: 26628-22-8, CAUTION
Sodium cytrate dihydrate	J.T. Baker	0280	CAS: 6132-04-3
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC	IDT
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha	Invitrogen	18265-017
Suspension cell culture plates (24-well)	Greiner Bio-One	662102	24-well
Suspension cell culture plates (12-well)	Greiner Bio-One	665102	12-well
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202
TAE buffer	ThermoFisher Scientific	B49	Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water
Transposase-containing plasmid			Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express Enzyme	Invitrogen	12605-028	store at 4 °C
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT	IDT
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550
Water bath	Tulabo
Xylene	Klinipath	4055-9005	CAS: 1330-20-7, CAUTION
Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x