Isolement et caractérisation des ligaments utéro-sacrés murins et des organes du plancher pelvien

Summary

Cet article présente un protocole détaillé pour disséquer les ligaments utéro-sacrés et d’autres tissus du plancher pelvien, y compris le col de l’utérus, le rectum et la vessie chez la souris, afin d’élargir l’étude des tissus reproducteurs féminins.

Abstract

Le prolapsus des organes pelviens (POP) est une affection qui affecte l’intégrité, la structure et le soutien mécanique du plancher pelvien. Les organes du plancher pelvien sont soutenus par différentes structures anatomiques, y compris les muscles, les ligaments et le fascia pelvien. Le ligament utéro-sacré (LSU) est une structure portante critique, et une lésion de la LSU entraîne un risque plus élevé de développer un POP. Le présent protocole décrit la dissection des LSU murins et des organes du plancher pelvien, ainsi que l’acquisition de données uniques sur la composition et la fonction biochimiques de la LSU à l’aide de la spectroscopie Raman et de l’évaluation du comportement mécanique. Les souris sont un modèle inestimable pour la recherche préclinique, mais disséquer la LSU murine est un processus difficile et complexe. Cette procédure présente une approche pour guider la dissection des tissus du plancher pelvien murin, y compris la LSU, afin de permettre de multiples évaluations et caractérisations. Ce travail vise à faciliter la dissection des tissus du plancher pelvien par les scientifiques fondamentaux et les ingénieurs, élargissant ainsi l’accessibilité de la recherche sur la LSU et les conditions du plancher pelvien et l’étude préclinique de la santé des femmes à l’aide de modèles murins.

Introduction

Environ 50 % des femmes sont touchées par le prolapsus des organes pelviens (POP)^1,2. Environ 11 % de ces femmes répondent aux critères pour subir une réparation chirurgicale, ce qui a un faible taux de réussite (~30 %)^3,4. Les POP se caractérisent par la descente de tout ou partie des organes pelviens (c.-à-d. vessie, utérus, col de l’utérus et rectum) de leur position naturelle en raison de l’incapacité de la LSU et des muscles du plancher pelvien à fournir un soutien adéquat⁵. Cette condition implique un dysfonctionnement anatomique et une perturbation du tissu conjonctif, ainsi que des lésions neuromusculaires, en plus des facteurs prédisposants ^3,6. Les POP sont associés à de multiples facteurs tels que l’âge, le poids, la parité et le type d’accouchement (c.-à-d. les naissances vaginales ou césariennes). On pense que ces facteurs affectent l’intégrité mécanique de tous les tissus du plancher pelvien, la grossesse et la parité étant considérées comme les principaux moteurs du POP ^5,7,8.

Les ligaments utéro-sacrés (LSU) sont des structures de soutien importantes pour l’utérus, le col de l’utérus et le vagin et attachent le col de l’utérus au sacrum⁴. Les dommages causés aux LSU exposent les femmes à un risque accru de développer des POP. On croit que la grossesse et l’accouchement imposent une pression supplémentaire sur la LSU, ce qui peut induire des blessures et augmenter les risques de POP. La LSU est un tissu complexe composé de cellules musculaires lisses, de vaisseaux sanguins et de lymphatiques répartis de manière hétérogène le long du ligament, qui peut être divisé en trois sections distinctes: cervicale, intermédiaire et sacrée⁹. L’intégrité mécanique de la LSU est dérivée de composants de la matrice extracellulaire (ECM) comme le collagène, l’élastine et les protéoglycanes ^5,9,10. Les fibres de collagène de type I sont connues pour être un composant de traction porteur majeur des tissus ligamenteux et sont, par conséquent, probablement impliquées dans la défaillance de la LSU et du POP¹¹.

Il y a un manque de connaissances sur les causes, la prévalence et les effets des POP chez les femmes. Le développement d’un modèle animal approprié de POP est nécessaire pour faire progresser notre compréhension du plancher pelvien féminin. Les souris et les humains ont des repères anatomiques similaires dans le bassin, tels que les uretères, le rectum, la vessie, les ovaires et les ligaments ronds⁹, ainsi que des points d’intersection similaires de la LSU avec l’utérus, le col de l’utérus et le sacrum. De plus, les souris offrent une facilité de manipulation génétique et ont le potentiel d’être un modèle facilement accessible et rentable pour l’étude du POP⁹.

Cette étude a mis au point une méthode pour accéder à la LSU et aux différents tissus du plancher pelvien et les isoler chez des souris nullipares (c.-à-d. jamais gestantes). Les LSU extraits ont été soumis à une digestion enzymatique (c.-à-d. pour éliminer les collagènes et les glycosaminoglycanes), testés pour déterminer la réponse mécanique sous charge de traction et évalués pour la composition biochimique dans une étude de validation de concept. La capacité d’isoler des tissus intacts facilitera d’autres caractérisations mécaniques et biochimiques des composants du plancher pelvien, ce qui constitue une première étape cruciale pour améliorer notre compréhension des risques de blessures liés à l’accouchement, à la grossesse et aux POP.

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Protocol

Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été effectuées conformément au protocole #2705, approuvé par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Colorado à Boulder. Des souris C57BL/6J femelles âgées de six semaines ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).

1. Préparation des animaux

1. Euthanasier l’animal selon la méthode approuvée par l’établissement.
   REMARQUE : La présente étude a utilisé l’inhalation de CO 2 conformément aux lignes directrices de l’American Veterinary Medical Association (un taux de déplacement de 30 % à 70 % du volume de la chambre avec du CO₂ par minute), suivie d’une luxation cervicale, pour assurer une euthanasie réussie.
   1. Travaillez sous une cagoule, si possible, pour minimiser la propagation des allergènes de souris. Une fois que la souris cesse de bouger et de respirer, attendez 2 minutes ou plus pour vérifier l’absence de réponse.
      REMARQUE: Si la souris est enceinte ou post-partum, les chiots doivent être euthanasiés individuellement. Les chiots E15.5 et plus âgés doivent être décapités pendant la dissection.
2. Préparez la configuration de dissection à l’aide d’un tampon de dissection, d’un scalpel à 11 lames, de ciseaux pointus minces et incurvés, de deux paires de pinces, de pinces incurvées, d’une suture polyglactine 5-0, d’un microscope à dissection et de six broches (figure 1, voir le tableau des matériaux).
3. Placez la souris sur le pad et épinglez les membres antérieurs vers le bas (Figure 2A). Faites une incision d’environ 1 à 1,5 cm dans l’abdomen avec des ciseaux (figure 2B). Utilisez doucement les ciseaux pour séparer la peau aux côtés crânien, caudal et latéral de l’incision (Figure 2C, D).
4. Retournez la souris sur sa face dorsale et décollez doucement la peau vers les membres postérieurs pour éloigner la peau du site de dissection (figure 2E-H).
5. Épinglez la souris aux membres (figure 2I) et faites une incision d’environ 1 cm dans l’abdomen, du thorax au bassin (figure 2J).
   REMARQUE: Assurez-vous de ne pas endommager les organes sous-jacents.
6. Poussez doucement les organes vers le thorax pour dégager le champ de vision (Figure 2K).
   REMARQUE: Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation.
7. Enlevez tout le tissu adipeux du plancher pelvien (figure 2L-N).
   REMARQUE: Utilisez des pinces pour retirer doucement et éliminer la graisse des organes et des tissus d’intérêt.

Figure 1 : Un espace de travail propre avec tous les outils nécessaires pour effectuer les dissections. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Enlèvement de la peau et ouverture des cavités pelviennes et thoraciques de la souris. (A) Épingler tous les membres. (B) Incision initiale. (C) Séparer la peau du fascia sous-jacent à l’aide de ciseaux. (D) Coupe de la peau et préparation de l’enlèvement. (E-G) Arracher la peau en faisant le tour de la souris. (H) Enlever complètement la peau de la face dorsale. (I) Enlèvement complet de la peau du torse et réépinglage des membres de la souris. (J) Ouverture de l’abdomen. K) Vue de l’abdomen ouvert. (L) Déplacement des organes hors du champ de vision. (M) Enlever la graisse. (N) Vue du plancher pelvien dégagé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Récolte de LSU

1. Coupez les cornes utérines des ovaires (Figure 3B), éloignez-vous du champ de vision et coupez au niveau de la connexion cervicale (Figure 3C).
   REMARQUE: Les cornes utérines peuvent être identifiées selon le schéma de la figure 3A. Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation.
2. Coupez les uretères loin du raccord de la vessie (Figure 3D).
   NOTE: Ceci afin d’éviter toute confusion avec la LSU.
3. Coupez le côlon le plus près possible du col de l’utérus (Figure 3E,F).
   REMARQUE: Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation.
4. Placez la souris avec le tampon de dissection sous la lunette de dissection pour visualiser les LSU (Figure 3G).
5. Utilisez doucement les pinces pour nettoyer la graisse environnante des LSU.
   REMARQUE: Utilisez une deuxième paire de pinces pour maintenir le col de l’utérus à un petit angle afin d’améliorer la visualisation de l’endroit où l’USL croise le col de l’utérus. Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation.
6. Attachez une suture polyglactine 5-0 autour de l’extrémité cervicale des deux USL (Figure 4B, C).
   REMARQUE : Les LSU peuvent être identifiées à l’aide des images schématiques et d’agrandissement (Figure 4I-K)
7. Dans cette étude, une LSU est utilisée pour les analyses morphologiques ou biochimiques (c.-à-d. microscopie Raman, immunohistochimie, histologie). Coupez l’extrémité cervicale de la LSU, en laissant un morceau du col de l’utérus attaché, et coupez un morceau de muscle du bas de la LSU (figure 4D). Placez le tissu disséqué dans un bain avec 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 4G, H).
8. Utilisez la LSU restante pour les essais mécaniques et l’imagerie. Coupez l’extrémité cervicale de la LSU, en laissant un morceau du col de l’utérus attaché, pour faciliter la configuration mécanique (figure 4D).
   REMARQUE: Le tissu cervical servira d’ancrage pour fixer l’USL pendant le test mécanique.
9. Une fois que tous les tissus d’intérêt sont prélevés (étapes 3 à 5), disloquez les fémurs du bassin (figure 4E).
   REMARQUE: On devrait entendre un léger cliquetis lorsque la tête fémorale est désarticulée de la coupe acétabulaire.
10. Couper l’os pelvien des extrémités distales et proximales de l’os pelvien, en laissant environ 10 mm de tissu total (figure 4F). Placez le tissu disséqué dans 1x PBS.

Figure 3 : Plancher pelvien dégagé pour la dissection de la LSU. (A) Schéma de l’anatomie. (B) Couper les cornes utérines à la connexion ovarienne. (C) Couper les cornes utérines. D) Coupe des uretères. (E) Coupe du côlon. (F) Une vue claire du rectum et des LSU. (G) Placer la souris et le tampon de dissection sous la lunette de dissection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Vue de la LSU et des tissus environnants et dissection des LSU. (A) Schéma des repères anatomiques entourant la LSU. (B) Attacher une suture autour des extrémités cervicales. (C) Trancher les extrémités cervicales de la LSU. (D) Découpage de la LSU à utiliser pour les analyses biochimiques à la connexion sacrée. E) Coupe des fémurs de l’os pelvien. (F) Couper l’extrémité proximale du bassin. (G) Dissection de l’USL dans une boîte de Petri de 35 mm. H) La LSU avec le bassin attaché dans une boîte de Pétri de 35 mm. (I) La LSU et le rectum à un grossissement de 0,75x. (J) Élimination de la graisse de la LSU. (K) Nettoyage des USL à un grossissement de 1,0x. Barre d’échelle = 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Prélèvement de la vessie

1. Une fois la graisse éliminée, tenez la vessie avec la pince et soulevez-la doucement à un angle d’environ 40° (figure 5A).
2. Avec les ciseaux, trancher la vessie du côté distal, juste au-dessus du col de l’utérus (figure 5B).
3. Placez le tissu dans un bain avec 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 5H).

4. Prélèvement du rectum

1. Une fois que les LSU sont déconnectées du col de l’utérus et que la vessie est disséquée, soulevez le col de l’utérus à un angle d’environ 40° avec la pince. Il y a le fascia rectovaginal qui relie le rectum et le col de l’utérus. Avec le scalpel, coupez délicatement cette connexion (Figure 5C, D).
2. Couper l’os pubien à la symphyse pubienne à l’aide de ciseaux. Élargissez doucement l’espace de travail pour augmenter l’accès visuel aux insertions tissulaires.
3. Avec la pince, tirez doucement le rectum vers le thorax et utilisez les ciseaux pour suivre le rectum de sa face postérieure à l’anus. Coupez le rectum au niveau de l’anus (figure 5E).
4. Placez le tissu dans 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 5I).

5. Prélèvement du complexe col de l’utérus-vagin

1. Une fois les LSU retirées du col de l’utérus, utilisez les pinces pour maintenir le col de l’utérus. Coupez le col de l’utérus le plus près possible de la vulve à l’aide de ciseaux (Figure 5F, G).
   REMARQUE: Assurez-vous de couper la symphyse pubienne pour voir visuellement l’extrémité distale du vagin.
2. Placez le tissu dans 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 5J).

Figure 5 : Dissections de la vessie, du rectum et du col de l’utérus et du vagin. (A) Tenir la vessie en biais. (B) Couper la vessie. (C) Couper le tendon reliant le col de l’utérus et le rectum. (D) Le tendon à un grossissement de 1,0x. (E) Couper le rectum. (F) Tenir le col de l’utérus avec une pince. (G) Coupure à l’extrémité distale du vagin. (H) La vessie dans une boîte de Petri de 35 mm. (I) Le rectum dans une boîte de Petri de 35 mm. (J) Le complexe tissulaire col-vagin dans une boîte de Pétri de 35 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Préparation de l’échantillon pour la caractérisation tissulaire

1. Analyses mécaniques et visuelles de la LSU
   1. Placez la LSU avec l’attache pelvienne sur un mur en forme de T dans un puits de coloration personnalisé pour assurer une immersion complète dans la solution de coloration (les dessins CAO du puits se trouvent dans le fichier de codage supplémentaire 1 et le fichier de codage supplémentaire 2).
      REMARQUE: Utilisez la suture et les forceps pour faciliter le placement.
   2. Diluer un colorant disponible dans le commerce qui colore les groupes amines libres (5 μL, voir le tableau des matériaux) dans 2,5 mL de 1x PBS, ajouter la solution au puits de coloration personnalisé et colorer le tissu pendant 2 h sur une bascule à 4 °C.
      REMARQUE: Vortex la solution avant de l’ajouter au puits de coloration.
   3. Au cours des 15 dernières minutes de coloration, ajouter 2,5 μL d’une coloration de noyaux de cellules mortes disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) à la solution.
      REMARQUE: Vortex la solution avant de l’ajouter au puits de coloration.
2. Analyse Raman des USL
   1. Épinglez la LSU en ligne droite sur un bloc de polydiméthylsiloxane (PDMS) contenu dans un puits personnalisé.
      REMARQUE: Le PDMS est utilisé comme substrat souple pour permettre l’épinglage de l’échantillon dans la configuration souhaitée. Des blocs de dimensions variables peuvent être fabriqués en mélangeant les deux composants en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux), en coulant dans une boîte de Petri et, après polymérisation, en coupant le PDMS dans la géométrie requise avec une lame de scalpel.
   2. Épingler avec des épingles d’insectes à la boucle de suture et au muscle pelvien. Hydratez le tissu avec 1x PBS.
3. Tissus restants
   1. Congeler les tissus restants avec de l’azote liquide ou dans un composé d’enrobage approprié, selon les analyses souhaitées.
   2. Conservez les tissus à −80 °C jusqu’à des analyses ultérieures (p. ex. tests immunohistochimiques ou biochimiques).

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Results

Chaque étape de la dissection d’une souris de type sauvage est détaillée dans la vidéo associée et les figures liées au protocole. Pour cette étude, des souris C57BL/6J femelles âgées de 6 semaines ont été utilisées (tableau supplémentaire 1). Trois groupes d’échantillons avec des LSU traitées avec différentes enzymes ont été analysés: les groupes témoins (aucun traitement), les groupes traités à la collagénase et les groupes traités à la chondroïtinase. Le muscle lisse, les...

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Discussion

L’effet des dommages structurels sur les tissus reproducteurs féminins est sous-étudié, et un modèle animal facilement accessible pour la recherche sur les POP est nécessaire. La souris est un modèle rentable qui peut imiter les études sur la reproduction humaine¹⁶. En raison de l’intérêt croissant pour l’étude du système reproducteur féminin, il existe un besoin de méthodes qui facilitent l’étude de ces tissus. Pour répondre à ce besoin, dans ce travail, une méthode est ?...

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
11 Blade	Fisher	3120030	Removable blade
1x PBS	Fisher	BP399-1	Diluted from 10x concentration
Chondroitinase ABC	Sigma	C3667-10UN	Enzyme
Collagenase Type I	Worthington Biochemical	LS004194	Enzyme
Confocal Microscope	Leica	STELLARIS 5	Upright configuration
Dissection Microscope	Leica	S9E	With camera
Dumont #5 Forceps	Fisher	NC9626652	Thin tip
Female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #: 000664
FemtoTools Micromanipulator	FemtoTools	FT-RS1002	100 mN load cell
FST Curved Forceps	Fisher	NC9639443	Curved tip
FST Sharp 9 mm Scissors	Fisher	NC9639443	Dissection scissors
Ghost Dye 780	Tonbo	13-0865-T500	Free amine stain
Kimwipes	Fisher	06-666	Box of 50 wipes
OCT	Tissue Tek	4583	Used for tissue preservation
PDMS	Thermo Fisher	044764.AK	Follow manufacturer's instructions
Petri Dishes 35 mm	Fisher	FB0875711A	Used for dissected tissue
Polyglactin 5-0 Suture	Veter.Sut	VS385VL	With needle
Renishaw InVia Raman Microscope	Renishaw	PN192(EN)-02-A	With confocal objectives
Rocking Platform	VWR	10127-876	2 tier platform
Surgical Gloves	Fisher	52818	For dissection
Sytox	Thermo Fisher	S11381	Nuclear stain
T-pins	Fisher	S99385	For dissection
Transfer Pipets	Fisher	13-711-7M	For dissection
Underpads	Fisher	22037950	To cover dissection pad