Microinjection ciblée et électroporation d’organoïdes cérébraux de primates pour la modification génétique

Résumé

L’électroporation des organoïdes cérébraux des primates fournit une approche précise et efficace pour introduire des modifications génétiques transitoires dans différents types de progéniteurs et de neurones dans un système modèle proche du développement du néocortex (patho)physiologique des primates. Cela permet l’étude des processus neurodéveloppementaux et évolutifs et peut également être appliqué à la modélisation des maladies.

Résumé

Le cortex cérébral est la structure cérébrale la plus externe et est responsable du traitement des entrées sensorielles et des sorties motrices; Il est considéré comme le siège des capacités cognitives d’ordre supérieur chez les mammifères, en particulier les primates. L’étude des fonctions des gènes dans le cerveau des primates est difficile pour des raisons techniques et éthiques, mais la mise en place de la technologie organoïde du cerveau a permis l’étude du développement du cerveau dans des modèles traditionnels de primates (par exemple, le macaque rhésus et le ouistiti commun), ainsi que chez des espèces de primates auparavant inaccessibles expérimentalement (par exemple, les grands singes), dans un système éthiquement justifiable et moins exigeant techniquement. De plus, les organoïdes cérébraux humains permettent l’investigation avancée des troubles neurodéveloppementaux et neurologiques.

Comme les organoïdes cérébraux récapitulent de nombreux processus de développement du cerveau, ils représentent également un outil puissant pour identifier les différences et comparer fonctionnellement les déterminants génétiques sous-jacents au développement du cerveau de diverses espèces dans un contexte évolutif. Un grand avantage de l’utilisation d’organoïdes est la possibilité d’introduire des modifications génétiques, ce qui permet de tester les fonctions des gènes. Cependant, l’introduction de telles modifications est laborieuse et coûteuse. Cet article décrit une approche rapide et rentable pour modifier génétiquement les populations cellulaires dans les structures ventriculaires des organoïdes cérébraux des primates, un sous-type d’organoïdes cérébraux. Cette méthode combine un protocole modifié pour la génération fiable d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) humaines, chimpanzés, macaques rhésus et communes dérivées de ouistitis. Cela fournit un outil efficace pour l’étude des processus neurodéveloppementaux et évolutifs qui peut également être appliqué à la modélisation de la maladie.

Introduction

Étudier le développement (physio)physiologique et l’évolution du cortex cérébral est une tâche formidable qui est entravée par le manque de systèmes modèles appropriés. Auparavant, ces études se limitaient à des modèles de culture cellulaire bidimensionnelle (tels que les cultures de cellules neuronales primaires ou neuronales) et à des modèles animaux distants de l’évolution (tels que les rongeurs)^1,2. Bien que ces modèles soient utiles pour répondre à certaines questions, ils sont limités dans la modélisation de la complexité, de la composition du type cellulaire, de l’architecture cellulaire et des modèles ....

Protocole

1. Culture des CSPi des primates

REMARQUE: En raison de sa robustesse, la méthode présentée ici peut être appliquée à n’importe quelle lignée iPSC de primate. Dans cet article, nous décrivons la production d’organoïdes cérébraux à partir de lignées d’iPSC humaines (iLonza2.2)29, de chimpanzés (Sandra A)³⁰, de macaques rhésus (iRh33.1)²⁹ et de ouistiti commun (cj_160419_5)³¹. Les conditions de culture sont résumées dans le tableau 1. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les ma....

Discussion

Les procédures décrites ici représentent un protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux à partir de différentes espèces de primates avec une approche d’électroporation ciblée. Cela permet l’expression ectopique d’un GOI dans un système modèle qui émule le développement du néocortex (patho)physiologique des primates (y compris humains). Ce protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux de primates utilise les mêmes matériaux (p. ex., les mêmes milieux) et le.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 µL Microloader	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm cell culture dishes	Sarstedt	83.3900
60 mm cell culture dishes	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope	Zeiss		replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)	Gibco	17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)	Leica	10473849	replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel	Corning	354277/354234	basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Paraformaldehyde	Merck	818715	handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
Petri dish electrode chamber	self-produced (see Supplemental File 1)		also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	PeproTech	AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE	Gibco	12604-013	recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305