Alignement de données de séries chronologiques synchronisées à l’aide du modèle de synchronisation de perte de cycle cellulaire caractérisant pour les comparaisons entre expériences

Résumé

L’un des défis de l’analyse des expériences de séries chronologiques synchronisées est que les expériences diffèrent souvent par la durée de récupération de la synchronie et la période du cycle cellulaire. Ainsi, les mesures de différentes expériences ne peuvent pas être analysées globalement ou facilement comparées. Ici, nous décrivons une méthode d’alignement des expériences pour permettre des comparaisons spécifiques à la phase.

Résumé

L’étude du cycle cellulaire dépend souvent de la synchronisation des populations cellulaires pour mesurer divers paramètres dans une série chronologique lorsque les cellules traversent le cycle cellulaire. Cependant, même dans des conditions similaires, les expériences de répétition montrent des différences dans le temps nécessaire pour récupérer de la synchronie et traverser le cycle cellulaire, empêchant ainsi les comparaisons directes à chaque point temporel. Le problème de la comparaison des mesures dynamiques entre les expériences est exacerbé dans les populations mutantes ou dans d’autres conditions de croissance qui affectent le temps de récupération synchrone et / ou la période du cycle cellulaire.

Nous avons déjà publié un modèle mathématique paramétrique nommé Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) qui surveille la façon dont les populations synchrones de cellules se libèrent de la synchronie et progressent dans le cycle cellulaire. Les paramètres appris du modèle peuvent ensuite être utilisés pour convertir des points temporels expérimentaux d’expériences de séries chronologiques synchronisées en une échelle de temps normalisée (points de ligne de vie). Plutôt que de représenter le temps écoulé en minutes à partir du début de l’expérience, l’échelle de la ligne de vie représente la progression de la synchronie à l’entrée dans le cycle cellulaire, puis à travers les phases du cycle cellulaire. Étant donné que les points de survie correspondent à la phase de la cellule moyenne au sein de la population synchronisée, cette échelle de temps normalisée permet des comparaisons directes entre les expériences, y compris celles dont les périodes et les temps de récupération varient. En outre, le modèle a été utilisé pour aligner les expériences de cycle cellulaire entre différentes espèces (par exemple, Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe), permettant ainsi une comparaison directe des mesures du cycle cellulaire, ce qui peut révéler des similitudes et des différences évolutives.

Introduction

Les mesures de séries chronologiques effectuées sur des populations synchronisées de cellules au fur et à mesure qu’elles progressent dans le cycle cellulaire constituent une méthode standard pour étudier les mécanismes qui contrôlent la progression du cycle cellulaire 1,2,3,4,5,6,7,8 . La capacité de faire des comparaisons entre les expériences de séries chronologiques de synchronie / libération est essentielle à notre compréhension de ces processus dynamiques. L’utilisation d’expériences répétées pour corroborer les résultats peut accroître la confiance dans la reproductibilité des conclusions. En outre, les comparaisons entre les conditions environnementales, entre les mutants et même entre les espèces peuvent révéler de nombreuses nouvelles connaissances sur la régulation du cycle cellulaire. Cependant, la variabilité interexpérimentale dans la récupération de la synchronie et dans la vitesse de progression du cycle cellulaire nuit à la capacité de faire des comparaisons temporelles point à point entre les répétitions ou entre les expériences avec un calendrier du cycle cellulaire modifié. En raison de ces difficultés, les répétitions ne sont souvent pas incluses pour la série chronologique complète (p. ex., Spellman et ^coll.4). Lorsque des répétitions pour l’ensemble de la série chronologique sont recueillies, les données ne peuvent pas être analysées globalement, mais une seule répétition est utilisée pour l’analyse, et d’autres répétitions sont souvent reléguées à des chiffres supplémentaires (p. ex., Orlando et ^coll.8). En outre, les comparaisons entre les expériences présentant différentes caractéristiques de récupération ou de progression du cycle cellulaire sont difficiles. Les mesures d’intervalles plus petits entre un événement d’intérêt et un point de repère du cycle cellulaire (p. ex., émergence des bourgeons, entrée en phase S ou début de l’anaphase) peuvent aider à réduire les erreurs si ces événements marquants sont suivis 1,2,3,9,10,11,12. Cependant, des différences subtiles mais importantes peuvent rester non détectées ou masquées à l’aide de ces méthodes ad hoc. Enfin, les analyses unicellulaires permettent d’analyser la progression du cycle cellulaire sans recourir à la synchronisation ou à l’alignement¹³, bien que les mesures à grande échelle dans les études unicellulaires puissent être difficiles et coûteuses.

Pour surmonter ces difficultés, nous avons développé le modèle CLOCCS (Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony) pour faciliter l’analyse des mesures de séries chronologiques effectuées sur des populations synchronisées^14,15. CLOCCS est un modèle mathématique flexible qui décrit la distribution des cellules synchronisées à travers les phases du cycle cellulaire lorsqu’elles sont libérées de la synchronie et progressent dans le cycle cellulaire. Le cadre du processus de ramification permet au modèle de tenir compte des qualités asymétriques des cellules mères et filles après division, comme observé chez S. cerevisiae, tout en étant utile pour les organismes qui se divisent par fission, comme S. pombe. Le modèle peut prendre des entrées d’un ensemble diversifié de types de mesure pour spécifier la phase du cycle cellulaire. Il peut ingérer des données de phase du cycle cellulaire bourgeonnant, qui comprennent des mesures du pourcentage de cellules bourgeonnées au fil du temps, ce qui permet d’estimer le nombre de cellules en dehors de la phase G1 non bourgeonnée^14,15. Le modèle peut également ingérer des données cytométriques en flux qui mesurent la teneur en ADN, permettant ainsi d’évaluer les transitions marquantes de G1 à S, S à G2 et de M à G1¹⁵. Des marqueurs morphologiques fluorescents peuvent également être utilisés pour identifier la phase du cycle cellulaire. Le marquage fluorescent des anneaux de myosine, des noyaux et des corps de fuseau (SPB) peut être utilisé pour déterminer la phase du cycle cellulaire, et ceux-ci ont été incorporés dans le modèle CLOCCS¹¹; Toutefois, ces mesures ne seront pas décrites dans le présent protocole. De plus, l’indice de septation a été utilisé comme entrée pour les données de modélisation de S. pombe¹⁴. Ainsi, le modèle peut être utilisé pour les analyses du cycle cellulaire dans une variété d’organismes et peut être étendu davantage.

CLOCCS est un modèle paramétrique qui permet l’inférence bayésienne complète de plusieurs paramètres à partir des données d’entrée (par exemple, pourcentage bourgeonnant, contenu en ADN). Ces paramètres comprennent le temps de récupération de la synchronie, la durée de la période du cycle cellulaire (estimée séparément pour les cellules mères et filles) et la position moyenne du cycle cellulaire des cellules à chaque point temporel. Ces paramètres représentent le comportement de la cellule moyenne dans la population, permettant au chercheur de mapper chaque point temporel à une position du cycle cellulaire exprimée comme un point de ligne de vie. La conversion en points de ligne de vie dépend des paramètres CLOCCS lambda (λ) et mu0 (μ₀)^14,15. Le paramètre λ correspond à la période moyenne du cycle cellulaire des cellules mères. Cependant, en raison du retard^{mère-fille 14,15,} il ne s’agit pas de la période moyenne du cycle cellulaire de l’ensemble de la population qui comprend à la fois les cellules mère et fille. CLOCCS déduit en outre le paramètre delta (δ), qui correspond au délai mère-fille et, ainsi, permet le calcul de la période moyenne du cycle cellulaire de l’ensemble de la population. Enfin, étant donné que chaque expérience commence après la libération de la synchronisation du cycle cellulaire, le temps nécessaire pour récupérer à partir de la méthode de synchronisation est représenté par le paramètre CLOCCS μ₀. CLOCCS ajuste un modèle aux données de phase du cycle cellulaire d’entrée, puis déduit ces paramètres à l’aide d’un algorithme de Monte-Carlo à chaîne de Markov^14,15. En mappant plusieurs expériences à une échelle de temps de cycle cellulaire commune, des comparaisons directes spécifiques à la phase peuvent être effectuées entre des répétitions ou des expériences où le temps de récupération ou les périodes de cycle cellulaire ne sont pas identiques 8,14,15.

Comme les populations synchronisées perdent leur synchronie à un certain rythme au cours des séries chronologiques^14,15,16,17, la variabilité du taux de perte de synchronie peut également entraver les comparaisons quantitatives entre les expériences. En identifiant l’emplacement des populations et la variance de leurs répartitions, CLOCCS tient compte des différences dans les taux de perte de synchronie. Cet outil puissant permet des comparaisons spécifiques et détaillées entre les expériences, offrant ainsi la possibilité de faire directement des comparaisons pertinentes non seulement entre les répétitions, mais aussi entre les conditions environnementales, les mutants et même les espèces qui ont un calendrier de cycle cellulaire radicalement différent^14,15.

Cet article décrit une méthode utilisant CLOCCS pour estimer les paramètres en ajustant les données des expériences de séries chronologiques de synchronie/libération, mapper les données à une échelle de ligne de vie commune, puis effectuer des comparaisons pertinentes entre les répétitions ou les expériences. L’alignement de la ligne de vie permet des comparaisons directes spécifiques à la phase entre ces expériences, ce qui permet l’agrégation et la comparaison des répétitions et de faire des comparaisons plus pertinentes entre les expériences avec différents moments de récupération et périodes de cycle cellulaire.

Protocole

1. Collecte de données expérimentales et de phase du cycle cellulaire

1. Synchroniser les cellules par rapport au cycle cellulaire en utilisant la méthode de synchronisation souhaitée (p. ex., élutriation centrifuge telle que décrite dans Leman et al.18 ou arrêt des phéromones d’accouplement tel que décrit dans Rosebrock 19; Leman et al.18 et Rosebrock ¹⁹ incluent également des méthodes pour la libération de la synchronie). Commencer l’échantillonnage tout au long de la série chronologique, en veillant à ce que la série chronologique dure au moins deux cycles cellulaires complets et, de manière optimale, prélever au moins 10 échantillons par cycle cellulaire. À chaque point temporel, prélever un échantillon pour les données de phase du cycle cellulaire (bourgeonnement ou cytométrie en flux) et un échantillon pour les données expérimentales, comme décrit ci-dessous.
2. Si vous utilisez des données bourgeonnantes comme données de phase du cycle cellulaire, collectez des données sur le bourgeonnement pour l’alignement CLOCCS.
   1. Échantillon tout au long de la série chronologique. Pour chaque point temporel, prélever des cellules et les fixer en mélangeant 200 μL de culture cellulaire soniquée avec 200 μL de solution fixatrice, comme décrit dans Leman et ^al.18.
   2. Pour le bourgeonnement standard, comptez au moins 200 cellules par point temporel à l’aide d’un microscope optique transmis avec un objectif 40x et un hémocytomètre. Ajouter l’échantillon de cellules de l’étape 1.2.1 à l’hémocytomètre et diluer si la densité empêche le comptage. Notez le nombre de cellules bourgeonnées et non bourgeonnées à chaque point temporel. Calculez le pourcentage de cellules bourgeonnées et tracez pour chaque point temporel d’une courbe bourgeonnante.
      REMARQUE : D’autres méthodes de spécification des informations de phase du cycle cellulaire sont disponibles, mais elles ne sont pas décrites dans ce protocole. Les autres méthodes sont décrites dans le fichier CLOCCS readme et dans un ouvrage précédent¹¹.
3. Si vous utilisez des données de contenu d’ADN cytométrique en flux comme données de phase du cycle cellulaire, collectez des données de coloration de l’ADN par cytométrie en flux pour l’alignement CLOCCS cytométrique en flux.
   1. Échantillon tout au long de la série chronologique. Pour chaque point temporel, collectez des cellules et corrigez-les comme décrit dans Haase et Reed²⁰.
   2. Colorer l’ADN et analyser à l’aide d’une analyse cytométrique en flux standard. Un protocole de coloration recommandé pour S. cerevisiae est décrit dans Haase et Reed²⁰.
4. Recueillir des données omiques associées ou des données expérimentales connexes. Pour les données transcriptomiques standard, recueillir comme décrit dans Leman et ^al.18 et Kelliher et ^al.21,22. Assurez-vous que les données sont associées à des points temporels contenant des données de phase du cycle cellulaire pour permettre l’alignement en aval. Pour un alignement optimal, assurez-vous que des données de phase sont également associées à chaque point temporel contenant des données expérimentales.
   REMARQUE : Les données expérimentales peuvent prendre de nombreuses formes. Traditionnellement, nous utilisons la méthode d’alignement décrite pour aligner les expériences transcriptomiques de séries chronologiques. Cependant, tout type de données associées à des points temporels peut être aligné (c.-à-d. protéomique²²).

2. Installation du logiciel requis

Remarque : Cette section suppose que Conda, Java 19 et Git sont déjà installés (Table of Materials).

1. Téléchargez le référentiel CLOCCS_alignment en entrant la commande suivante dans le terminal:
   git clone git clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
2. Créez un environnement Conda à l’aide du fichier conda_req.yml en entrant la commande suivante dans le terminal dans le dossier où le référentiel CLOCCS_alignment a été cloné :
   conda env create -f conda_req.yml

3. Utiliser CLOCCS pour paramétrer les expériences

1. Double-cliquez sur le fichier cloccs_v2023.jar dans le dossier CLOCCS du référentiel CLOCCS_alignment et attendez qu’une interface utilisateur graphique s’ouvre. Cet écran permet de saisir des options pour l’exécution CLOCCS et affiche les résultats une fois exécutés.
2. Entrez les paramètres généraux.
   1. Définissez Sim Anneal, Graver et Itérations en tapant dans les zones de saisie de texte associées. Sim Anneal (recuit simulé) identifie les bonnes valeurs de paramètres de départ, Burn In recherche les modes postérieurs et l’étape finale permet de tirer toutes les inférences postérieures. Des valeurs plus élevées augmentent le temps d’exécution mais augmentent également la précision.
   2. Entrez les conditions expérimentales en spécifiant la température en degrés Celsius et la méthode de synchronisation à l’aide de la zone de texte intitulée Température et du menu déroulant Synchro. Méthode, respectivement.
   3. Vous pouvez éventuellement configurer les paramètres avancés dans le menu Paramètres avancés. Les paramètres avancés permettent de définir des préalables pour chacun des paramètres (« mu0 », « sigma0 », « sigmav », « lambda », « bud.start », « bud.end »).
      REMARQUE: Vous trouverez plus d’informations concernant les paramètres avancés dans le fichier readme.txt dans le dossier CLOCCS du référentiel CLOCCS_alignment.
3. Entrez les paramètres à utiliser avec les données naissantes.
   1. Choisissez la sélection appropriée dans le menu déroulant Type de modèle . L’option par défaut Bud est pour les informations standard sur le bourgeonnement de la levure bourgeonnante.
      REMARQUE: D’autres options plus avancées existent également dans le menu déroulant: Mutant pour les informations bourgeonnantes pour les mutants qui subissent plusieurs cycles de bourgeonnement sans division, BudSSLSMR pour les informations sur le bourgeonnement et les informations supplémentaires sur le corps du pôle de fuseau et l’anneau de myosine, et BudNucDivNeck pour les informations sur les bourgeons et les informations supplémentaires sur les noyaux de division et de col de bourgeon. Ces options avancées sont décrites dans le fichier CLOCCS readme et dans les travaux précédents^11,14,15.
   2. Importez les données à l’aide du panneau Importation de données en tapant dans les zones de saisie de texte ou en téléchargeant un fichier en cliquant sur le bouton Sélectionner un fichier . La première colonne spécifie les points temporels. Les deux colonnes restantes spécifient les données bourgeonnantes et peuvent prendre l’une des options suivantes : le nombre de cellules non bourgeonnées (No Bud), le nombre de cellules bourgeonnées (Budd) ou le nombre total de cellules (Total).
4. Entrez les paramètres à utiliser avec les données cytométriques en flux. Pour chaque expérience, exécutez l’étape 3.3 ou l’étape 3.4.
   REMARQUE: Les données cytométriques en flux et les données bourgeonnantes peuvent être utilisées ensemble. Bien que nous ayons décrit précédemment leur exécution ensemble¹⁵, pour cet outil, ils doivent être exécutés indépendamment puis comparés.
   1. Convertissez les fichiers .fcs dans le format d’entrée CLOCCS correct pour la cytométrie en flux en suivant les instructions du fichier supplémentaire 1 (également disponible dans le référentiel CLOCCS_alignment CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
   2. Sélectionnez la sélection Flux dans le menu déroulant Type de modèle .
   3. Importez les données à l’aide du panneau Importation de données. Cliquez sur Sélectionner un fichier, puis sélectionnez le fichier généré à l’étape 3.4.1.
   4. Sélectionnez les points temporels pour lesquels un ajustement CLOCCS cytométrique en flux doit être tracé en sélectionnant les points de temps dans la zone Temps d’ajustement .
5. Une fois que toutes les entrées ont été sélectionnées pour la cytométrie bourgeonnante ou en flux, cliquez sur le bouton Appliquer , puis cliquez sur le bouton Exemple en haut de l’écran.
6. Affichez la courbe bourgeonnante ou les diagrammes de cytométrie en flux avec les ajustements prévus en sélectionnant l’onglet Ajustements prévus . Cet onglet s’ouvre par défaut immédiatement après l’étape précédente.
7. Affichez les histogrammes de paramètres pour chaque paramètre en sélectionnant l’onglet Histogrammes des paramètres, puis en sélectionnant le sous-onglet correspondant au paramètre d’intérêt parmi les options suivantes : mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end, etc.
8. Affichez le tracé du score postérieur en sélectionnant l’onglet Score postérieur .
9. Affichez les paramètres et modifiez-les davantage en sélectionnant l’onglet Paramètres ; affichez le journal des exécutions précédentes en sélectionnant l’onglet Journal .
10. Obtenez les paramètres CLOCCS à partir de l’ajustement en sélectionnant l’onglet Paramètres postérieurs . La table résultante aura la forme suivante : chaque ligne se compose d’un paramètre, la dernière ligne étant la ligne postérieure. Les colonnes comprennent le paramètre prédit pour la moyenne, l’intervalle de confiance inférieur de 2,5 %, l’intervalle de confiance supérieur de 97,5 % et le taux d’acceptation.
    1. Enregistrer les paramètres utilisés pour l’alignement de chaque expérience : le temps de récupération de la synchronie (μ₀) et la durée moyenne du cycle cellulaire des cellules mères (λ).
    2. Calculez la période du cycle cellulaire en calculant la moyenne de la période de la cellule mère (λ) et de la période de la cellule fille (λ + δ), où δ est le délai spécifique à la fille.
       NOTE: Répétez la section 3 avec toutes les expériences à inclure dans les comparaisons.

4. Conversion des points temporels en points de ligne de vie à l’aide des fonctions de conversion Python et des paramètres CLOCCS

Remarque : La conversion entre les points de temps et les points de ligne de vie nécessite deux formules de conversion²¹. Une implémentation Python pour la conversion et la visualisation des données est disponible dans le référentiel CLOCCS_alignment et décrite ci-dessous.

1. Activez l’environnement Conda en entrant la commande suivante dans le terminal: conda activate CLOCCS_alignment
2. Ouvrez un bloc-notes Python interactif en tapant la commande suivante dans le terminal : jupyter notebook
3. Créez un bloc-notes Python dans le dossier souhaité.
   REMARQUE : un exemple de bloc-notes a été inclus pour illustrer l’utilisation standard et peut être trouvé dans Alignment/JOVE_example.ipynb dans le référentiel d’alignement CLOCCS_.
4. Importez le fichier Python contenant les fonctions d’alignement en exécutant la commande suivante dans la première cellule :
   %exécuter path_to_repo/cloccs_alignment/Alignement/utilitaires.py
   1. Remplacez le chemin d’accès au référentiel CLOCCS_alignment par path_to_repo.
5. Si vous utilisez des données bourgeonnantes comme données de phase du cycle de cellule, importez une trame de données contenant le pourcentage de bourgeonnement à chaque point temporel en exécutant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
   budding_df = pd.read_csv(« path_to_folder/budding_filename.tsv », sep ="\t », index_col=0)
   1. Remplacez le chemin d’accès et le nom de fichier appropriés. Si le fichier est un fichier .csv, supprimez sep ="\t »
6. Si vous utilisez des données bourgeonnantes comme données de phase du cycle cellulaire, alignez les données bourgeonnantes sur une échelle de temps de point de vie en entrant la fonction suivante dans une nouvelle cellule :
   aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, points de temps, param_mu0, param_lambda)
   1. Pour les points de temps, remplacez une liste des points de temps par l’index de la trame de données budding_df.
   2. Pour param_mu0 et param_lambda, remplacez l’expérience par les paramètres appris de l’exécution CLOCCS naissante dans la section 3.
7. Si vous utilisez des données de cytométrie en flux, importez les données de cytométrie en flux en exécutant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
   flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
   1. Par flow_input_folder, remplacez le chemin d’accès approprié au dossier contenant les fichiers .fcs de cytométrie en flux.
8. Si vous utilisez des données de cytométrie en flux, générez une table de conversion entre les points temporels et les points de ligne de vie pour chaque expérience en tapant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
   flow_converter = convert_tp_to_ll(points de temps, param_mu0, param_lambda)
   1. Pour les points temporels, remplacez une liste des points temporels des données de cytométrie en flux.
   2. Pour param_mu0 et param_lambda, remplacez l’expérience par les paramètres appris de la cytométrie en flux CLOCCS exécutée dans la section 3.
9. Importez la trame de données contenant les données expérimentales dans le bloc-notes en exécutant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
   data_df = pd.read_csv(« path_to_folder/exp_data_filename.tsv », sep ="\t », index_col=0)
   1. Remplacez le chemin d’accès et le nom de fichier appropriés. Si le fichier est un fichier .csv, supprimez sep ="\t ».
      Remarque : Cela peut être fait pour n’importe quelle donnée tabulaire. Les données expérimentales doivent simplement avoir les points temporels comme colonnes ou index de la trame de données. Des exemples de données peuvent être trouvés dans le référentiel CLOCCS_alignment.
10. Alignez les données expérimentales sur une échelle de temps de ligne de vie en entrant la fonction suivante dans une nouvelle cellule :
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, timepoints, param_mu0, param_lambda, interpolate, lowerll, upperll)
    1. Pour les points de temps, remplacez une liste des points de temps comme index ou les colonnes du data_df expérimental de l’étape précédente.
    2. Pour param_mu0 et param_lambda, remplacer les valeurs obtenues à la section 3 à partir de CLOCCS.
       Remarque : Les paramètres peuvent provenir de n’importe quelle exécution CLOCCS effectuée sur l’un des types de données de phase de cycle de cellule acceptés.
    3. Si vous le souhaitez, remplacez interpolate par True ou False, ou laissez vide (la valeur par défaut est False).
       Remarque : Lorsque la valeur False est attribuée, les données ne sont pas interpolées. Lorsque la valeur True est attribuée, les points de ligne de vie sont arrondis et interpolés pour remplir les valeurs entre les points de ligne de vie, de sorte qu’il y ait un point par entier dans la plage des points de ligne de vie. Cela permet une meilleure comparaison entre les ensembles de données.
    4. Vous pouvez également remplacer lowerll et upperll par des valeurs None ou entières.
       Remarque : Lorsque défini sur Aucun, tous les points de ligne de vie après interpolation sont conservés. Lorsque des entiers sont fournis, cela tronque les données de sorte que les points de ligne de vie vont de la ligne inférieure à la partie supérieure. Cela permet de comparer les ensembles de données avec un lowerll ou un upperll différent.
11. Téléchargez le jeu de données aligné sur la ligne de vie en entrant la commande suivante dans une nouvelle cellule : lifeline_aligned_df.to_csv(« path_to_desired_location/name_of_file.tsv », sep = « \t »)
12. Répétez les étapes 4.5-4.11 avec toutes les expériences à inclure dans les comparaisons.

5. Comparaison des courbes bourgeonnantes et des données de cytométrie en flux

1. Tracez les courbes bourgeonnantes avant l’alignement à l’aide de la fonction utilitaires Python en entrant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
   plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, titre = str_title)
   1. Remplacez le tracé par une liste contenant les trames de données de toutes les courbes bourgeonnantes souhaitées pour list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
   2. Remplacez la légende par une liste d’étiquettes [Expérience 1, Expérience 2, Mutant] leg_list si vous le souhaitez. Si ce n’est pas le cas, excluez ou remplacez Aucun.
   3. Remplacez le temps par str_type.
   4. Remplacez un titre de chaîne Comparaison des courbes bourgeonnantes par str_title si vous le souhaitez. Si ce n’est pas le cas, remplacez Aucun ou excluez.
2. Tracez les courbes bourgeonnantes après l’alignement à l’aide de la fonction utilitaires Python en suivant les instructions de l’étape 5.1, mais avec une liste de courbes bourgeonnantes alignées substituées à list_of_budding_curves et avec une ligne de vie pour point_type au lieu du temps.
3. Pour tracer les données de cytométrie en flux, tracez les données associées à partir des fichiers .fcs aux points de ligne de vie correspondants à l’aide du convertisseur généré à l’étape 4.8.
4. Convertissez les points de ligne de vie en phase de cycle cellulaire à l’aide de la table de conversion (Tableau 1).
   REMARQUE: Cela peut également être tracé en suivant les instructions de l’étape 5.1, mais avec une phase pour point_type au lieu de temps.

6. Comparaison des données expérimentales

1. Déterminez la liste des gènes à tracer dans les graphiques linéaires en fonction de l’information de la littérature ou des gènes d’intérêt pour la recherche.
2. Utilisez les plot_linegraph_comparison fournies dans le fichier d’utilitaires Python pour effectuer des comparaisons de graphiques linéaires sur le bloc de données d’origine, aligné ou aligné et interpolé en tapant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
   plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, généliste, point_type = str_type, titre = str_title)
   1. Substituez une liste des cadres de données des expériences à comparer à list_of_dfs.
      Remarque : Les blocs de données peuvent être désalignés ou alignés ; Toutefois, les point_type correspondantes doivent être saisies à l’étape 6.2.4.
   2. Remplacez une liste des titres pour chaque bloc de données dans le même ordre que la liste des blocs de données pour list_for_legend.
   3. Substituer une liste des noms de gènes (qui doivent être inclus dans l’index des bases de données) à tracer pour la liste génétique.
   4. Remplacez le type de point par str_type. Utilisez la ligne de vie (la valeur par défaut est l’échelle de point de ligne de vie ) ou la phase (l’échelle de ligne de vie de phase du cycle cellulaire) pour les blocs de données alignés à l’étape 6.2.1 ou le temps pour les blocs de données non alignés à l’étape 6.2.1.
   5. Remplacez str_title titre de chaîne facultatif.
3. Déterminez la liste des gènes à inclure dans la carte thermique à l’aide de la littérature ou des algorithmes pour déterminer les gènes les plus périodiques.
   REMARQUE : Pour des comparaisons appropriées de cartes thermiques, les données doivent être alignées, interpolées et ajustées en fonction de l’échelle de temps à l’étape 6.2; Il devrait avoir la même valeur de ligne de vie de début et de fin pour chaque expérience.
   1. Exécutez des algorithmes de périodicité pour déterminer les gènes périodiques les plus élevés^23,24, ou utilisez les méthodes alternatives souhaitées pour déterminer la liste des gènes (c.-à-d. les résultats de la littérature).
   2. Importez un fichier de liste de gènes .csv ou .tsv dans le bloc-notes à l’aide de la commande suivante dans une nouvelle cellule :
      sort_df =.read_csv(« path_to_folder/sorting_filename.tsv », sep="\t », index_col=0)
   3. Remplacez le chemin d’accès et le nom de fichier appropriés. S’il s’agit d’un fichier .csv, supprimez sep="\t ».
4. Utilisez la fonction fournie plot_heatmap_comparison dans le fichier d’utilitaires Python pour effectuer une comparaison de carte thermique sur le bloc de données aligné, interpolé et aligné en phase en tapant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
   plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, généliste, titre = str_title)
   1. Remplacez une liste des cadres de données alignés des expériences à comparer pour list_of_dfs.
   2. Remplacez une liste des titres pour chaque bloc de données dans le même ordre que la liste des blocs de données pour list_for_legend.
   3. Substituer une liste des noms de gènes (qui doivent être inclus dans l’index des bases de données) à tracer pour la liste génétique.
   4. Remplacez str_title titre de chaîne facultatif.
      REMARQUE: Le premier bloc de données de la liste est celui qui sera utilisé pour ordonner les gènes dans la carte thermique. Les gènes seront ordonnés par maximum dans la première période pour cette trame de données, et le même ordre sera utilisé pour les trames de données suivantes dans la liste.

Résultats

Les étapes décrites dans le protocole ci-dessus et dans le flux de travail de la figure 1 ont été appliquées à cinq expériences de séries chronologiques synchronisées à cycle cellulaire pour démontrer deux comparaisons représentatives: entre des répétitions avec différentes méthodes de synchronie (phéromone d’accouplement et élutriation centrifuge¹⁸) et des plates-formes de séquençage (séquençage de l’ARN [séquençage de l’ARN [séquençag...

Discussion

Cet article présente une méthode permettant d’évaluer plus précisément et quantitativement les données provenant d’expériences de séries chronologiques sur des populations synchronisées de cellules. La méthode utilise les paramètres appris de CLOCCS, un modèle d’inférence bayésien qui utilise des données de phase du cycle cellulaire d’entrée, telles que les données bourgeonnantes et les données de contenu d’ADN cytométrique en flux, pour paramétrer chaque expérience^14,15

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde			For Fixative Solution.
100% Ethanol			For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer			For flow cytometry protocol.
Git			https://git-scm.com/
Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope			For counting cells and buds.
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris			pH 7.5