Système de modèle intestinal tridimensionnel (3D) de base avec une composante immunitaire

Résumé

Nous décrivons ici la construction d’un système modèle de base de lignées cellulaires intestinales tridimensionnelles (3D) et d’un protocole d’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes. La coloration de protéines sélectionnées permet d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience en vue d’une utilisation potentielle dans des études précliniques de criblage de médicaments.

Résumé

Il y a eu une augmentation de l’utilisation de modèles intestinaux in vivo et in vitro pour étudier la physiopathologie des maladies inflammatoires intestinales, pour le criblage pharmacologique de substances potentiellement bénéfiques et pour les études de toxicité sur des composants alimentaires potentiellement nocifs. Il est important de noter qu’il existe actuellement une demande pour le développement de modèles in vitro à base de cellules pour remplacer les modèles animaux. Ici, un protocole pour un modèle de base d’équivalent intestinal tridimensionnel (3D) de « tissu sain » utilisant des lignées cellulaires est présenté avec le double avantage d’offrir à la fois une simplicité expérimentale (système standardisé et facilement reproductible) et une complexité physiologique (entérocytes Caco-2 avec une composante immunitaire de soutien des monocytes U937 et des fibroblastes L929). Le protocole comprend également l’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes, offrant ainsi l’avantage d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience. Des coupes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) montrant les cellules cylindriques Caco-2 formant une monocouche serrée et régulière dans les traitements témoins sont utilisées pour vérifier l’efficacité du modèle en tant que système expérimental. En utilisant le gluten comme composant alimentaire pro-inflammatoire, les paramètres analysés à partir des coupes comprennent une épaisseur de monocouche réduite, ainsi qu’une perturbation et un détachement de la matrice sous-jacente (H & E), une diminution de l’expression de la protéine de jonction serrée comme le montre la coloration à l’occludine (quantifiable statistiquement) et l’activation immunitaire des cellules U937 migrantes, comme en témoigne la coloration en grappe de différenciation 14 (CD14) et la différenciation liée à CD11b en macrophages. Comme le montre l’utilisation de lipopolysaccharides pour simuler l’inflammation intestinale, des paramètres supplémentaires qui peuvent être mesurés sont l’augmentation de la coloration du mucus et l’expression des cytokines (telles que la midkine) qui peuvent être extraites du milieu avant la fixation. Le modèle de base tridimensionnel (3D) de la muqueuse intestinale et les coupes fixes peuvent être recommandés pour les études de l’état inflammatoire et de l’intégrité de la barrière avec la possibilité d’analyser plusieurs paramètres visuels quantifiables.

Introduction

La barrière épithéliale intestinale, une paroi interne d’une cellule d’épaisseur contenant différents types de cellules épithéliales, constitue la première barrière défensive physique ou interface entre le milieu extérieur et le milieu interne du corps ^1,2. Les entérocytes de type cylindrique constituent le type de cellules épithéliales le plus abondant. Ceux-ci sont responsables du maintien de l’intégrité de la barrière épithéliale grâce à des interactions entre plusieurs composants de la barrière, y compris les jonctions serrées (TJ), jouant un rôle important dans le resserrement de la barrière

Protocole

1. Préparation du modèle de base de la muqueuse intestinale reconstruite en 3D

REMARQUE : L’ensemble de la procédure doit être effectué dans une hotte à flux laminaire stérile. Toutes les étapes de la procédure impliquant l’utilisation de l’incubateur cellulaire signifient que les cultures sont incubées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂ (sauf indication contraire dans le protocole_).

1. Préparation préalable des lignées cellulaires utilisées dans le système modèle intestinal
   1. Semez des cellules de fibroblastes de souris L929 à une concentration de 5 x 10⁵ dans 5 mL de mi....

Discussion

Le système modèle de base de la muqueuse intestinale reconstruite présenté ici (Figure 6) combine la complexité physiologique (cultures cellulaires 3D plus pertinentes sur le plan physiologique contenant une monocouche Caco-2 avec un support de lamina propria riche en MEC contenant des fibroblastes et des monocytes) et la simplicité expérimentale (utilisation de lignées cellulaires humaines commerciales pour produire un système standardisé et facilement reproductible)