Approche unique pour isoler les neutrophiles de la moelle osseuse du rat avec une capacité comparable

Résumé

Cette recherche décrit deux techniques pour isoler les pièges extracellulaires neutrophiles abondants (TNE) de la moelle osseuse du rat. Une méthode combine un kit d’isolement des neutrophiles commercial avec une centrifugation à gradient de densité, tandis que l’autre utilise uniquement la centrifugation à gradient de densité. Les deux approches produisent des TNE fonctionnelles surpassant celles des neutrophiles du sang périphérique.

Résumé

L’objectif principal de cette recherche était de développer une approche fiable et efficace pour isoler les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) de la moelle osseuse du rat. Cet effort est dû aux limites associées à la méthode traditionnelle d’extraction des TNE du sang périphérique, principalement en raison de la rareté des neutrophiles disponibles pour l’isolement. L’étude a révélé deux méthodologies distinctes pour obtenir des neutrophiles de rat à partir de la moelle osseuse : une procédure simplifiée en une étape qui a donné des niveaux de purification satisfaisants, et un processus en deux étapes plus long qui a montré une efficacité de purification améliorée. Il est important de noter que les deux techniques ont produit une quantité substantielle de neutrophiles viables, allant de 50 à 100 millions par rat. Cette efficacité reflétait les résultats obtenus en isolant les neutrophiles de sources humaines et murines. De manière significative, les neutrophiles dérivés de la moelle osseuse du rat présentaient des capacités comparables à sécréter des TNE par rapport aux neutrophiles obtenus à partir du sang périphérique. Cependant, la méthode basée sur la moelle osseuse a systématiquement produit des quantités nettement plus importantes de neutrophiles et de TNE. Cette approche a démontré le potentiel d’obtenir des quantités significativement plus importantes de ces composants cellulaires pour d’autres applications en aval. Notamment, ces TNE et neutrophiles isolés sont prometteurs pour une gamme d’applications, couvrant les domaines de l’inflammation, des infections et des maladies auto-immunes.

Introduction

Les neutrophiles constituent un sous-ensemble essentiel de leucocytes qui jouent un rôle central dans la réponse immunitaire innée. Ils sont caractérisés par des noyaux et des granules multilobés contenant diverses protéases et peptides antimicrobiens¹. Les neutrophiles fonctionnent principalement par dégranulation, phagocytose et formation de TNE. L’observation des TNE a été faite pour la première fois par Takei et al. en 1996 lors d’une expérience où les neutrophiles ont été stimulés avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA)². Par la suite, le processus de formation des TNE a été baptisé « NETose » par Brinkmann et ^al.3 en 2004. Leurs recherches ont mis en lumière le rôle crucial des TNE dans les réponses antimicrobiennes médiées par les neutrophiles. Les TNE sont des structures en forme de toile composées de chromatine, d’histones et de protéines antimicrobiennes qui sont libérées par les neutrophiles activés en réponse à des stimuli infectieux et inflammatoires. Les TNE peuvent immobiliser et tuer les agents pathogènes envahissants en les piégeant et en les exposant à une forte concentration de peptides et de protéases antimicrobiens ^1,3. De plus, les TNE contribuent à l’élimination des cellules apoptotiques et participent à la résolution de l’inflammation. Des études récentes indiquent également qu’une formation excessive de TNEs ou une dégradation altérée des TNE peut entraîner des lésions tissulaires, des troubles auto-immuns, une thrombogenèse et une altération de la revascularisation 4,5,6,7,8,9,10.

Le rôle pathogène des TNE dans la fibrose non contrôlée après un infarctus du myocarde et la formation d’anévrismes ventriculaires a été démontré par l’expansion de la fibrose périvasculaire ^4,11. Le modèle d’infarctus du myocarde et l’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse chez la souris sont tous deux bien établis. Les leucocytes polymorphonucléaires (PMN), un type de globule blanc abondant dans le sang humain, constituent une excellente source pour isoler les neutrophiles humains. Cette méthode élimine le besoin de prélever de la moelle osseuse, améliorant ainsi la sécurité et l’efficacité.

Les TNE jouent également un rôle dans la fibrillation auriculaire associée au remodelage cardiaque. Cependant, de gros animaux tels que des chiens et des porcs ont été utilisés pour modéliser la fibrillation auriculaire, car les souris n’ont pas d’oreillette suffisamment grande pour établir un cycle de ré-entrée ou le modèle AF, à moins que des canaux ioniques ou des voies de signalisation spécifiques ne soient renversés ou éliminés¹². Bien qu’il soit possible d’induire la fibrillation auriculaire chez le rat et d’isoler les neutrophiles du sang périphérique du rat comme décrit précédemment, les chercheurs ont rencontré une limite selon laquelle seuls 2 x 10^5-5 x 10⁵ neutrophiles pouvaient être isolés du sang périphérique (10 ml par rat). L’extraction d’un nombre suffisant de TNE à chaque point nécessitait environ 10 à 25 rats (5 x 10⁶ neutrophiles au total), ce qui entraînait un processus long, coûteux et souvent à faible rendement¹³. À cet égard, Li He et ses collègues présentent une stratégie axée sur la moelle osseuse pour obtenir des TNE adéquates à partir de rats¹⁴. Dans leur article, ils fournissent une description complète de l’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse du rat et comparent les capacités de sécrétion de TNE des neutrophiles périphériques et de la moelle osseuse du rat. Les deux méthodes décrites répondent à des objectifs expérimentaux distincts, les deux aboutissant à des quantités suffisantes de neutrophiles de moelle osseuse de rat tout en réduisant le nombre de rats nécessaires. La méthode d’isolement en deux étapes a démontré une purification supérieure des neutrophiles, tandis que la méthode en une étape s’est avérée efficace en termes de temps avec des niveaux de purification acceptables. De plus, les chercheurs ont comparé la NETosis et la formation de TNE entre les neutrophiles de la moelle osseuse du rat et leurs homologues périphériques, trouvant une puissance égale à celle de la PMN. Ces résultats contribuent de manière significative aux études de la fibrillation auriculaire liées aux neutrophiles et soulignent l’importance de sélectionner de manière flexible différentes sources d’isolement des neutrophiles chez divers animaux de laboratoire avec des distributions de neutrophiles différentes.

Protocole

L’étude a été réalisée dans le cadre d’une licence de projet (n° 20211404A) accordée par le Comité d’éthique animale de l’Hôpital de Chine occidentale de l’Université du Sichuan, conformément aux directives du Comité d’éthique animale de l’Hôpital de Chine occidentale de l’Université du Sichuan pour le soin et l’utilisation des animaux. Conformément aux directives éthiques, les rats utilisés dans cette étude ont été maintenus dans un environnement contrôlé avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures, une température de 22 à 24 °C et une humidité de 50 % à 60 %. Les rats ont eu accès à de la nourriture et à de l’eau à volonté. Les animaux utilisés dans cette étude étaient des rats mâles Sprague Dawley (SD) âgés de 6 à 8 semaines, pesant environ 250 g et exempts d’agents pathogènes spécifiques. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières).

1. Isolement des neutrophiles du rat

1. Prélèvement de moelle osseuse
   1. Placez le rat dans un récipient approprié pour l’anesthésie (voir le tableau des matériaux). Administrer 3 % d’isoflurane au rat jusqu’à ce que l’animal soit inconscient. Vérifiez l’absence de réponse à un pincement des orteils ou de la queue pour assurer la profondeur de l’anesthésie.
   2. Une fois le rat profondément anesthésié, effectuez une luxation cervicale en plaçant le rat sur le dos et en tenant sa queue d’une main tout en saisissant la tête de l’autre main. Disloquez le cou rapidement et fermement en appliquant une force soudaine et forte vers le haut sur la queue tout en tirant la tête vers le bas jusqu’à ce que la colonne cervicale soit sectionnée. Attendez la confirmation du décès, comme l’arrêt de la respiration et l’absence de battements cardiaques, avant de procéder au prélèvement ou à l’élimination des tissus.
   3. Trempez le rat dans de l’éthanol à 75% et laissez-le reposer quelques minutes pour stériliser la fourrure et la peau. Allongez le rat sur le dos et coupez les membres inférieurs de la hanche pour protéger la tête du fémur. Utilisez des ciseaux de dissection pour couper le ligament au niveau de l’articulation du jarret et repliez l’articulation du genou vers l’arrière pour exposer le fémur et le tibia.
   4. À l’aide de pinces et de ciseaux, retirez soigneusement les muscles, tendons et autres tissus reliés aux os. Rincez les os avec la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour éliminer les débris tissulaires et le sang restants. Répétez deux fois de plus, pour un total de trois lavages. Placez les os nettoyés dans un récipient stérile.
   5. Utilisez une seringue de 5 ou 10 ml avec une aiguille pour enfoncer la moelle à travers les deux extrémités de l’os afin de détacher la matrice de moelle. Rincer la moelle osseuse avec 10 à 15 ml de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec une autre seringue, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de moelle osseuse visible.
   6. Centrifuger les cellules de la moelle osseuse à 300 x g pendant 10 min à 20 °C. Ajouter 5 à 10 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir la table des matières) pour remettre les cellules en suspension et incuber à température ambiante pendant 3 min. Ajouter 4 fois le volume de HBSS au mélange. Centrifuger les cellules à 600 x g pendant 5 min à température ambiante, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et utiliser la pastille obtenue pour une utilisation ultérieure.
2. Isolement des neutrophiles dans la moelle osseuse
   1. Pour la méthode en deux étapes, effectuez les étapes supplémentaires suivantes :
      1. Isoler les cellules de la moelle osseuse à l’aide de la trousse d’isolement des neutrophiles de rat commercialisée en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matières).
      2. Préparez un gradient de densité en superposant 2 mL de réactif percoll à 55 % (voir le tableau des matériaux), 2 mL de 65 % du réactif, 2 mL de réactif à 70 % et 2 mL de réactif à 80 % dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger le tube à 800 x g pendant 40 min à 20 °C, avec l’accélération réglée sur 5 et la décélération réglée sur 0 ou 1.
      3. Prélever la couche de gradient de 70 %, y compris les couches cellulaires à la limite entre le réactif de gradient de 65 % et 70 %, à l’aide d’une pipette stérile. Transférer la suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger de 15 ml. Ajouter 15 mL de HBSS dans le tube et retourner doucement le tube plusieurs fois pour laver les cellules. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 10 min à température ambiante pour granuler les cellules.
   2. Pour la méthode en une étape, effectuez les étapes supplémentaires suivantes :
      1. Soumettre les cellules de la moelle osseuse aux gradients sans utiliser le kit d’isolement des neutrophiles chez le rat.
      2. Prélevez la couche de gradient de 70 %, y compris les couches cellulaires à la limite entre 65 % et 70 %, à l’aide d’une pipette stérile. Transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger de 50 ml et lavez les cellules avec HBSS. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules.
      3. Compter les neutrophiles isolés à l’aide d’un hémocytomètre et évaluer la viabilité à l’aide d’une coloration au bleu trypan.
         REMARQUE : Le protocole peut être modifié en fonction du nombre de rats et du nombre souhaité de neutrophiles isolés. Une quantité acceptable d’os est obtenue à partir de trois rats lorsque cette méthode est utilisée pour la première fois dans un nouveau cadre expérimental. Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles. L’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse doit être effectué le plus rapidement possible pour minimiser les dommages cellulaires et la perte de viabilité.

2. Acquisition de NET pour rats

1. Mettre en suspension 0,5 x 10^8-1 x 10⁸ neutrophiles isolés dans un milieu RPMI de 4 mL (complété par 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine) dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm.
2. Ajouter 500 nM de PMA (voir le tableau des matériaux) à la suspension de neutrophiles pour induire la NETosis. Incuber pendant 3 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
3. Pour le témoin négatif, ajouter de la DNase I (10 U/mL) dans la suspension de neutrophiles pour dégrader les TNE sécrétées.
4. Pour récolter les TNE, retirez le milieu et lavez délicatement les TNE attachées à la boîte de Pétri avec HBSS. Ensuite, utilisez un rinçage intense avec 4 ml de milieu frais pour chaque plaque afin de détacher les TNE de la plaque.
5. Prélevez fréquemment le produit de lavage et pipetez pour une remise en suspension complète des TNE.
6. Centrifuger la suspension à 300 × g pendant 10 min à 20 °C pour éliminer les cellules flottantes.
7. Transférer la suspension contenant les TNE dans un tube stérile et conserver à −20 °C pour une utilisation ultérieure dans les 2 semaines.
   REMARQUE : Les TNE sont sensibles à la dégradation, il est donc recommandé d’utiliser du matériel fraîchement récolté pour de meilleurs résultats.

3. Vérification de la présence de TNE

1. Fixer les cellules (à partir de l’étape 2.4) sur des lamelles avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min et des TNE (à partir de l’étape 2.7) pendant 30 min à 1 h.
2. Retournez la lamelle sur une gouttelette PBS/PBST sur un support de tube à essai recouvert d’un film de paraffine et répétez le processus de lavage trois fois pendant 5 minutes chacun.
3. Perméabiliser les cellules avec 0,5 % de Triton-X-100 pendant 10 min à température ambiante et laver trois fois dans du PBS/PBST pendant 1 min chacune. Scellez les cellules avec le sérum d’âne normal à 10 % (voir tableau des matériaux) à température ambiante pendant 1 heure.
4. Incuber les cellules avec l’anticorps anti-élastase neutrophile et l’anticorps anti-myéloperoxydase anti-rat (voir tableau des matières) pendant une nuit à 4 °C. Ensuite, laver la lamelle dans PBS/PBST trois fois pendant 5 minutes chacune.
5. Incuber les cellules avec l’anticorps secondaire A488 IgG (H + L) anti-lapin conjugué à l’âne, l’IgG anti-souris à l’âne conjugué A594 (H + L) et l’anticorps IgG1 anti-souris à la chèvre conjugué A594 (voir tableau des matières) à température ambiante pendant 1 h dans l’obscurité. Ensuite, laver la lamelle dans PBS/PBST trois fois pendant 5 minutes chacune.
6. Noyaux de cellules colorantes et squelettes de TNE avec 10 mg/mL de DAPI. Ensuite, laver la lamelle dans PBS/PBST trois fois pendant 5 minutes chacune.
7. Placez une goutte de support de montage sur une lame de verre et retournez la lamelle avec des cellules dessus. Laissez sécher pendant 1 h pour une analyse microscopique avec des lentilles d’immersion ; sinon, il est prêt à être inspecté.
   REMARQUE : Il faut faire très attention lors de la manipulation des TNE, même après fixation, car elles sont extrêmement fragiles et peuvent facilement être perdues pendant la préparation.

4. Quantification des TNE

1. Préparer le tampon Tris-EDTA (TE) et la solution de travail PicoGreen (réactif de test d’ADNdb) conformément aux instructions du fabricant (voir la table des matériaux).
2. Préparer les étalons en diluant l’ADN de la mère à des concentrations de 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL et 1 μg/mL.
   REMARQUE : Pour quantifier la concentration de TNE, la trousse d’analyse de l’ADNdb (voir le tableau des matières) a été utilisée, conformément aux directives du fabricant. Le tampon Tris-EDTA (TE) et les réactifs de test d’ADNdb ont été préparés en utilisant un volume de 19 fois d’eau doublement distillée ou un volume de 199 fois de tampon TE, respectivement. Par la suite, des solutions étalons (1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL et 1 μg/mL) ont été préparées, et chaque 50 μL de l’échantillon a été combiné avec 450 μL de tampon TE.
3. Ajouter 50 μL de chaque échantillon à 450 μL de tampon TE.
4. Ajouter 100 μL d’étalons ou d’échantillons ainsi qu’un volume égal de solution de travail de réactif d’essai dans chaque puits dans une plaque de 96 puits, y compris les étalons et les échantillons.
5. Incuber la plaque à température ambiante pendant 2 à 5 minutes, en évitant la lumière directe.
6. Lisez les échantillons à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence avec un spectre d’émission d’environ 530 nm et un spectre d’absorbance d’environ 480 nm.
7. Calculer la concentration de TNE dans chaque échantillon à l’aide de la courbe standard générée par les étalons.

5. Analyse de la sécrétion de TNE par cytométrie cellulaire

1. Ajouter une coloration du noyau (voir le tableau des matériaux) aux cellules incubées dans la plaque à 96 puits pour atteindre une concentration finale de 10 ng/mL et incuber pendant 30 min.
2. Ajouter de l’ADN acellulaire (cfDNA, voir Tableau des matériaux) colorer les cellules pour atteindre une concentration finale de 300 nM et incuber pendant 10 min.
3. Mélanger les colorants fluorescents par pipetage doux. Ne jetez pas le surnageant et ne lavez pas la pastille.
4. Chargez la plaque d’échantillon dans l’instrument cytométrique.
5. Réglez les paramètres de mise au point et de temps d’exposition pour les différents canaux : bleu (ex : 377/50 nm, em : 470/22 nm), généralement avec une exposition de 30 000 ms, vert (ex : 483/32 nm, eM : 536/40 nm) généralement avec une exposition de 5 000 ms.
6. Capturez des images très uniformes de l’ensemble de la plaque sur différents canaux.
7. Analysez le nombre de taches du noyau pour différents groupes. S’ils sont similaires, la sécrétion de TNE peut être déterminée par le nombre de colorants d’ADNcf.

Résultats

Le protocole décrit ici délimite deux méthodes distinctes, chacune caractérisée par une purification améliorée ou des étapes simplifiées. Les deux méthodes ont donné environ 0,5 x 10^8-1 x 10⁸ neutrophiles par rat. L’analyse par cytométrie en flux, utilisant le kit de détection de l’apoptose annexine V-FITC/PI, a montré une viabilité cellulaire supérieure à 90 %, comparable à celle de la souris et de l’homme (Figure 1). Alors que la contamination ...

Discussion

L’isolement des neutrophiles constitue une étape cruciale dans l’étude de la NETosis, où le choix d’une méthode d’isolement appropriée est primordial pour obtenir des résultats fiables. Un facteur important à prendre en compte est la survenue d’une contamination lymphocytaire pendant l’isolement. Il est particulièrement important de relever ce défi lorsqu’il s’agit d’isoler les neutrophiles de rat de la moelle osseuse. Malgré la gamme de densité distincte des neutrophiles (1,0814-1,0919, avec...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100