Approche unique pour isoler les neutrophiles de la moelle osseuse du rat avec une capacité comparable

Résumé

Cette recherche décrit deux techniques pour isoler les pièges extracellulaires neutrophiles abondants (TNE) de la moelle osseuse du rat. Une méthode combine un kit d’isolement des neutrophiles commercial avec une centrifugation à gradient de densité, tandis que l’autre utilise uniquement la centrifugation à gradient de densité. Les deux approches produisent des TNE fonctionnelles surpassant celles des neutrophiles du sang périphérique.

Résumé

L’objectif principal de cette recherche était de développer une approche fiable et efficace pour isoler les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) de la moelle osseuse du rat. Cet effort est dû aux limites associées à la méthode traditionnelle d’extraction des TNE du sang périphérique, principalement en raison de la rareté des neutrophiles disponibles pour l’isolement. L’étude a révélé deux méthodologies distinctes pour obtenir des neutrophiles de rat à partir de la moelle osseuse : une procédure simplifiée en une étape qui a donné des niveaux de purification satisfaisants, et un processus en deux étapes plus long qui a montré une efficacité de purification améliorée. Il est important de noter que les deux techniques ont produit une quantité substantielle de neutrophiles viables, allant de 50 à 100 millions par rat. Cette efficacité reflétait les résultats obtenus en isolant les neutrophiles de sources humaines et murines. De manière significative, les neutrophiles dérivés de la moelle osseuse du rat présentaient des capacités comparables à sécréter des TNE par rapport aux neutrophiles obtenus à partir du sang périphérique. Cependant, la méthode basée sur la moelle osseuse a systématiquement produit des quantités nettement plus importantes de neutrophiles et de TNE. Cette approche a démontré le potentiel d’obtenir des quantités significativement plus importantes de ces composants cellulaires pour d’autres applications en aval. Notamment, ces TNE et neutrophiles isolés sont prometteurs pour une gamme d’applications, couvrant les domaines de l’inflammation, des infections et des maladies auto-immunes.

Introduction

Les neutrophiles constituent un sous-ensemble essentiel de leucocytes qui jouent un rôle central dans la réponse immunitaire innée. Ils sont caractérisés par des noyaux et des granules multilobés contenant diverses protéases et peptides antimicrobiens¹. Les neutrophiles fonctionnent principalement par dégranulation, phagocytose et formation de TNE. L’observation des TNE a été faite pour la première fois par Takei et al. en 1996 lors d’une expérience où les neutrophiles ont été stimulés avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA)². Par la suite, le processus de formation des TNE a été baptisé « NETose » par Brinkmann ....

Protocole

L’étude a été réalisée dans le cadre d’une licence de projet (n° 20211404A) accordée par le Comité d’éthique animale de l’Hôpital de Chine occidentale de l’Université du Sichuan, conformément aux directives du Comité d’éthique animale de l’Hôpital de Chine occidentale de l’Université du Sichuan pour le soin et l’utilisation des animaux. Conformément aux directives éthiques, les rats utilisés dans cette étude ont été maintenus dans un environnement contrôlé avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures, une température de 22 à 24 °C et une humidité de 50 % à 60 %. Les rats ont eu accès à de la nourriture et à de l’eau à volonté. Les animaux utilisés dans cette étude éta....

Discussion

L’isolement des neutrophiles constitue une étape cruciale dans l’étude de la NETosis, où le choix d’une méthode d’isolement appropriée est primordial pour obtenir des résultats fiables. Un facteur important à prendre en compte est la survenue d’une contamination lymphocytaire pendant l’isolement. Il est particulièrement important de relever ce défi lorsqu’il s’agit d’isoler les neutrophiles de rat de la moelle osseuse. Malgré la gamme de densité distincte des neutrophiles (1,0814-1,0919, avec.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100