Hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour la localisation de longs ARN non codants dans les cellules d’ostéosarcome humain

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode d’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour localiser les ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome humain.

Résumé

Les rôles importants des longs ARN non codants (ARNlnc) dans le cancer ont été étudiés, tels que la régulation de la prolifération, de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), de la migration, de l’infiltration et de l’autophagie des cellules cancéreuses. La détection de localisation des ARNlnc dans les cellules peut donner un aperçu de leurs fonctions. En concevant la séquence de chaîne antisens spécifique de l’ARNlnc suivie d’un marquage avec des colorants fluorescents, l’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN (FISH) peut être appliquée pour détecter la localisation cellulaire des ARNlnc. Avec le développement de la microscopie, les techniques RNA FISH permettent même aujourd’hui de visualiser les ARNlnc faiblement exprimés. Cette méthode permet non seulement de détecter la localisation des ARNlnc seuls, mais aussi de détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines en utilisant l’immunofluorescence bicolore ou multicolore. Ici, nous avons inclus la procédure d’opération expérimentale détaillée et les précautions de l’ARN FISH en utilisant le gène hôte 6 (SNHG6) du petit ARN nucléolaire de l’ARN lnc dans les cellules d’ostéosarcome humain (143B) à titre d’exemple, afin de fournir une référence pour les chercheurs qui souhaitent effectuer des expériences RNA FISH, en particulier lncRNA FISH.

Introduction

Notre compréhension du génome humain a été considérablement élargie par les progrès récents de la technologie du génome entier. Environ 93 % du génome humain peut être transcrit en ARN, mais seulement 2 % des ARN peuvent être traduits en protéines ; les 98 % restants d’ARN qui n’ont pas de fonction de traduction protéique sont appelés ARN non codant (ARNnc)¹. En tant que classe d’ARN non codants (ARNnc), les ARNnc longs (ARNlnc), contenant plus de 200 nucléotides², ont attiré une attention croissante en raison de leur implication dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques des cellules, tels que la différenciation, le contrôle du cycle, l’apoptose, la migration et l’invasion ^3,4,5. Les ARNlnc jouent leur rôle par le biais de divers mécanismes, tels que la régulation de la structure de la chromatine et de l’expression des gènes nucléaires, le contrôle du processus d’épissage de l’ARNm et la modification post-transcriptionnelle⁶. Les ARNlnc régulent l’apparition, le développement et les métastases des tumeurs malignes aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel. La régulation transcriptionnelle est réalisée dans le noyau en affectant la transcription de l’ARN via la liaison aux structures chromosomiques, tandis que la régulation post-transcriptionnelle est réalisée dans le cytoplasme en contrôlant les gènes cibles via un mécanisme d’ARN compétitif endogène (ARNce) ^5,7,8. L’ARNc a révélé un nouveau mécanisme d’interaction avec l’ARNc, à savoir que les ARNlnc peuvent agir comme une éponge pour adsorber les miARN et inhiber la dégradation médiée par les miARN des gènes cibles apparentés⁹. Par conséquent, les informations concernant la localisation subcellulaire des ARNlnc, qu’un ARNlnc spécifique soit situé dans le cytoplasme ou le noyau, sont importantes pour aider à identifier leurs fonctions biologiques.

À l’heure actuelle, la localisation de l’ARNlnc est principalement détectée par deux méthodes, l’une par test d’isolement de fraction noyau/cytoplasme, et l’autre par ARN FISH. Dans le premier cas, les ARN des fractions cytoplasmique et nucléaire sont extraits respectivement, puis l’amplification par PCR est réalisée avec des amorces d’ARNlnc spécifiques pour détecter le rapport des ARNlnc dans le cytoplasme et le noyau. L’avantage de cette méthode est l’efficacité temporelle, tandis que l’inconvénient est que la localisation réelle de l’ARNlnc n’est pas directement reflétée par la proportion relative d’ARNlnc dans le cytoplasme et le noyau. RNA FISH peut détecter la localisation de l’ARNlnc dans les cellules grâce à la conception de séquences de chaînes antisens spécifiques à l’ARNlnc, suivie d’un marquage avec des colorants fluorescents¹⁰. Les méthodes RNA FISH ont été améliorées grâce aux progrès des techniques de sonde et des méthodes de détection, y compris les ensembles de sondes à oligosondes multiples^marquées aux fluorophores 11, les sondes LNA 12 et les sondes à ADN ramifié (ADNb)¹³. L’ARN FISH peut non seulement détecter la localisation de l’ARNlnc, mais aussi détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines en utilisant l’immunofluorescence bicolore ou multicolore¹⁴.

Dans ce travail, nous avons inclus le protocole détaillé de détection de localisation intracellulaire du gène hôte 6 (SNHG6) du petit ARN nucléolaire de l’ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome (143B) par RNA FISH à titre d’exemple. SNHG6 est un ARNlnc nucléotidique de 600 à 730 dans sa forme épissée mature et identifié comme un nouvel oncogène dans divers cancers humains, notamment le cancer colorectal, le cancer gastrique, le carcinome à cellules claires de l’ovaire, l’ostéosarcome et le carcinome hépatocellulaire^15,16,17,18. Des études ont confirmé l’implication de SNHG6 dans les comportements biologiques des cellules cancéreuses, tels que la prolifération, l’EMT et l’autophagie, et ont montré la localisation cytoplasmique de SNHG6 où il peut affecter les gènes cibles en se liant (éponger) les miARN^15,16,17. Ce protocole détaillé de détection de la localisation intracellulaire de SNHG6 par RNA FISH est présenté ici.

Protocole

Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole. La figure 1 montre le protocole global pour l’ARN FISH ; Le tableau 1 contient la composition de toutes les solutions et le tableau 2 contient les séquences d’amorces utilisées dans ce protocole.

1. Préparation de la sonde

1. Identifier et acquérir la séquence FASTA d’un ARNlnc cible d’intérêt, par exemple, à partir de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). En suivant les indications sur le site Web, concevez les sondes ISH en ligne¹⁹ et passez en revue les suggestions de l’algorithme de conception pour répertorier les sondes à commander avec l’étiquette Cy3.
2. Incuber le tampon d’hybridation à 37 °C pendant 2 h à l’avance.
3. Dissoudre la sonde à 4 densités optiques (OD) dans 160 μL de ddH₂O traité au diéthylpyrocarbonate (DEPC) à la concentration de 1 mg/mL à l’abri de la lumière.
   REMARQUE : La densité optique (OD) représente l’unité de mesure de l’ADN et de l’ARN. Habituellement, 1 unité OD = 33 μg/mL d’ADN.
4. Préparer 200 μL du mélange de sonde pour chaque puits (1,2 μL-10 μL de sonde, 70 μL de tampon d’hybridation, compléter le volume avec du ddH₂O à 200 μL traité par DEPC) et mettre en place une série de 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL et 6 μg/mL.
   REMARQUE : La concentration de la sonde doit être explorée expérimentalement à l’avance. Une concentration élevée de sonde conduira à une liaison non spécifique des ARNlnc, tandis qu’une faible concentration de sonde conduira à une détection insensible ou à l’échec de la détection des ARNlnc.
5. Dénaturer le mélange de sonde à 73 °C pendant 5 min.
   REMARQUE : Si la sonde d’ADN marquée Cy3 est double brin, dénaturez la sonde en ADN simple brin à 95 °C pendant 5 minutes, puis refroidissez rapidement pendant 2 minutes sur de la glace.

2. Préparation des cellules

1. Ensemencer 50 000 cellules 143B par puits sur des lamelles de verre stériles dans une plaque de culture cellulaire à 12 puits et les incuber pendant 24 h (37 °C, 5 % CO₂) dans du DMEM.
   REMARQUE : Le nombre spécifique de cellules ensemencées ici varie en fonction de la taille des cellules, ce qui est approprié pour que les cellules ensemencées atteignent une confluence de 50% après avoir été incubées pendant 24 h. Les lamelles en verre stériles sont rondes pour s’adapter à la plaque à 12 puits.
2. Retirez le milieu et lavez pendant 2 x 5 min avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   REMARQUE : Préparez 1x PBS avec du ddH₂O traité par DEPC. Le PBS sans traitement DEPC ne peut pas être utilisé car il contient de la RNase. Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions exemptes de RNase.
3. Retirez 1x PBS et ajoutez 200 μL d’éthanol à 100 % dans chaque puits pour fixer pendant 15 min à température ambiante.
4. Retirer l’éthanol, ajouter 200 μL de Triton X-100 à 0,1 % (dans 1 PBS) dans chaque puits et incuber pendant 15 min à température ambiante.
   REMARQUE : Le temps doit être strictement contrôlé avec la perméabilisation Triton X-100 et ne doit pas être trop long.
5. Retirez 0,1 % de Triton X-100 et lavez 2 x 5 min avec 1x PBS.
   REMARQUE : Si le protocole doit être interrompu ici, remplacez le PBS par de l’éthanol à 70% (dilution de l’éthanol à 100% avec du ddH₂O sans RNase) et conservez l’échantillon à 4 °C jusqu’à 3 mois.
6. Retirer 1x PBS, ajouter 200 μL de tampon 2x citrate salin de sodium (SSC) (dilution de 20x SSC avec du ddH₂O sans RNase) dans chaque puits, et incuber pendant 30 min à 37 °C.
7. Retirez 2 tampons SSC, ajoutez 200 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et incubez pendant 3 minutes à température ambiante.
8. Jeter l’éthanol à 70 %, ajouter 200 μL d’éthanol à 85 % (dilution de l’éthanol à 100 % avec du ddH₂O sans RNase) dans chaque puits et incuber pendant 3 min à température ambiante.
9. Jetez l’éthanol à 85 %, ajoutez 200 μL d’éthanol à 100 % dans chaque puits et incubez pendant 3 minutes à température ambiante.
10. Absorber et jeter 100 % d’éthanol ; Laissez sécher les puits.

3. Hybridation in situ par fluorescence (FISH)

1. Ajouter 200 μL de mélange de sondes (dénaturé comme à l’étape 1.5) dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant la nuit (16-18 h).
   NOTE : Il existe une forte corrélation positive entre la température d’hybridation et la concentration de la sonde ; Par conséquent, pour optimiser le bruit de fond, la température d’hybridation et la concentration de la sonde doivent être réduites.
2. Le lendemain, prélevez des échantillons à 37 °C et jetez le mélange de sondes. Ajouter 200 μL de tampon 0,4x SSC/0,3 % Tween-20 dans chaque puits (préchauffé à 65 °C) et laver pendant 2 min à température ambiante.
3. Retirez le tampon 0,4x SSC/0,3 % Tween-20, ajoutez 200 μL de tampon 2x SSC/0,1 % Tween-20 dans chaque puits et lavez pendant 2 minutes à température ambiante.
4. Retirer 2 tampons SSC/0,1 % Tween-20, ajouter 200 μL de solution colorante 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 μg/mL) et colorer pendant 20 minutes à l’abri de la lumière.
5. Jetez la solution de colorant DAPI et lavez avec 1x PBS pendant 2 min à température ambiante.
6. Ajoutez 50 μL de médium de montage contenant de la gomme sur la lame et placez la lamelle en verre sur la lame pour la fixer.
   REMARQUE : Assurez-vous de placer la lamelle sur la lame avec le côté de la cellule vers le bas.
7. Observez au microscope à fluorescence.
   REMARQUE : Utilisez un microscope à fluorescence ou un microscope confocal laser ; Ce dernier produit une imagerie plus sensible et plus claire.

Résultats

Des images représentatives de SNHG6 FISH dans des cellules d’ostéosarcome humain sont présentées (Figure 2). Le contrôle négatif est traité avec la sonde Ctrl négative ; Le contrôle positif est traité avec la sonde U6 ²⁰. La sonde SNHG6 et la sonde U6 sont marquées avec Cy3, qui émet une fluorescence rouge. Le DAPI est un colorant qui colore l’ADN, qui émet une fluorescence bleue. Ce résultat montre que SNHG6 est principalement localisé dans le cyto...

Discussion

Ce protocole RNA FISH peut non seulement détecter la localisation des ARNlnc dans les cellules, mais aussi détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines dans les cellules, qui peuvent également être utilisés pour détecter l’emplacement des ARNlnc dans les tissus enrobés de paraffine. Cependant, le protocole spécifique dans de tels cas est différent car les tissus enrobés de paraffine doivent être déparaffinés²¹. Cette procédure expérimentale peut être appliquée da...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
Cell culture plate-12	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	3513,corning	Place the coverslips in the plate
Cell line (143B)	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	CRL-8303	osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Coverslips	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	abs7026	The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe	Shanghai GenePharma Co.,Ltd	A10005	Detect SNHG6 location
DMEM media	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	LM-E1141	Cell culture medium
Dry Bath Incubator	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	DKT200-2	Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	10009218	dehydration
Fluorescence microscope	Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD	Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus	Observation and positioning
Incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD	DHP-9051	The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E675004	Attach the coverslips to the slide
Shaker	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	TS-8S	Washing sample
Slide	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	188105	The coverslips is placed on the slide
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600198	Permeable membrane and nuclear membrane
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells
Tween-20	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600560	detergent