Cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux co-cultivées avec des cellules gliales mixtes primaires pour réduire l’inflammation induite par les prions

Résumé

Les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (AdMSC) ont de puissantes propriétés immunomodulatrices utiles pour traiter les maladies associées à l’inflammation. Nous montrons comment isoler et cultiver des AdMSC murins et des cellules gliales mixtes primaires, stimuler les AdMSCs pour réguler à la hausse les gènes anti-inflammatoires et les facteurs de croissance, évaluer la migration des AdMSCs et co-cultiver des AdMSCs avec des cellules gliales mixtes primaires infectées par des prions.

Résumé

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont de puissants régulateurs de l’inflammation grâce à la production de cytokines anti-inflammatoires, de chimiokines et de facteurs de croissance. Ces cellules montrent une capacité à réguler la neuroinflammation dans le contexte de maladies neurodégénératives telles que la maladie à prions et d’autres troubles du mauvais repliement des protéines. Les maladies à prions peuvent être sporadiques, acquises ou génétiques ; Ils peuvent résulter du mauvais repliement et de l’agrégation de la protéine prion dans le cerveau. Ces maladies sont invariablement mortelles, sans traitement disponible.

L’un des premiers signes de la maladie est l’activation des astrocytes et de la microglie et l’inflammation associée, qui se produit avant l’agrégation détectable des prions et la perte neuronale ; ainsi, les propriétés anti-inflammatoires et régulatrices des CSM peuvent être récoltées pour traiter l’astrogliose dans la maladie à prions. Récemment, nous avons montré que les CSM dérivées du tissu adipeux (AdMSC) co-cultivées avec des cellules BV2 ou des cellules gliales mixtes primaires réduisent l’inflammation induite par les prions par la signalisation paracrine. Cet article décrit un traitement fiable utilisant des AdMSC stimulées pour réduire l’inflammation induite par les prions.

Une population hétérozygote d’AdMSC peut facilement être isolée du tissu adipeux murin et développée en culture. La stimulation de ces cellules avec des cytokines inflammatoires améliore leur capacité à migrer vers l’homogénat cérébral infecté par les prions et à produire des modulateurs anti-inflammatoires en réponse. Ensemble, ces techniques peuvent être utilisées pour étudier le potentiel thérapeutique des CSM sur l’infection à prions et peuvent être adaptées à d’autres maladies neuro-inflammatoires et de mauvais repliement des protéines.

Introduction

L’inflammation gliale joue un rôle clé dans diverses maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer et les maladies à prions. Bien que l’agrégation anormale des protéines soit attribuée à une grande partie de la pathogenèse de la maladie et de la neurodégénérescence, les cellules gliales jouent également un rôle dans l’exacerbation de ce ^1,2,3. Par conséquent, cibler l’inflammation induite par les glies est une approche thérapeutique prometteuse. Dans la maladie à prions, la protéine prion cellulaire (PrP^C) se replie à tort e....

Protocole

Les souris ont été élevées et entretenues au Lab Animal Resources de l’État du Colorado, accrédité par l’Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International, conformément au protocole #1138, approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Colorado.

1. Isoler et infecter la glie mixte corticale primitive avec des prions

1. Pour isoler une glie mixte primaire contenant à la fois des astrocytes et des microglies, obtenir des petits souris C57Bl/6 âgés de zéro à deux jours.
   REMARQUE : Ce protocole est adapté des protocoles précédents

Résultats

La stimulation des CSMads avec du TNFα ou de l’interféron-gamma (IFNγ) pendant 24 h induit des modifications de l’expression des molécules anti-inflammatoires et des facteurs de croissance. Le traitement des CSMadAd avec du TNFα ou de l’interféron-gamma (IFNγ) augmente l’ARNm du gène 6 stimulé par le TNF (TSG-6), tandis que le TNFα, mais pas l’IFNγ, provoque une augmentation de l’ARNm du facteur de croissance transformant bêta-1 (TGFβ-1). La stimulation avec du TNFα ou de l’I.......

Discussion

Ici, nous démontrons un protocole fiable et relativement peu coûteux pour évaluer les effets des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (AdMSC) dans la diminution de l’inflammation induite par les prions dans un modèle de cellules gliales. Les AdMSCs peuvent facilement être isolées et développées en culture pour une utilisation en aussi peu qu’une semaine. Ce protocole produit systématiquement une population hétérologue de cellules qui expriment des marqueurs compatibles avec ceux.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641