Virus pseudotypés en tant qu’outil moléculaire pour surveiller les réponses immunitaires humorales contre le SRAS-CoV-2 via un test de neutralisation

Résumé

Les virus pseudotypés (PV) sont des virions défectueux de réplication qui sont utilisés pour étudier les interactions hôte-virus dans des conditions plus sûres que la manipulation de virus authentiques. Nous présentons ici un protocole détaillé qui montre comment les PV du SRAS-CoV-2 peuvent être utilisés pour tester la capacité de neutralisation du sérum des patients après la vaccination contre la COVID-19.

Résumé

Les virus pseudotypés (PV) sont des outils moléculaires qui peuvent être utilisés pour étudier les interactions hôte-virus et pour tester la capacité neutralisante d’échantillons de sérum, en plus de leur utilisation plus connue en thérapie génique pour l’administration d’un gène d’intérêt. Les PV sont défectueux dans la réplication car le génome viral est divisé en différents plasmides qui ne sont pas incorporés dans les PV. Ce système sûr et polyvalent permet l’utilisation de PV dans des laboratoires de niveau de biosécurité 2. Nous présentons ici une méthodologie générale pour produire des PV lentiviraux à partir de trois plasmides mentionnés ici : (1) le plasmide de squelette portant le gène rapporteur nécessaire au suivi de l’infection ; (2) le plasmide d’emballage portant les gènes de toutes les protéines structurelles nécessaires à la génération des PV ; (3) le plasmide d’expression de la glycoprotéine de surface de l’enveloppe qui détermine le tropisme du virus et intervient dans l’entrée virale dans la cellule hôte. Dans ce travail, la pointe du SRAS-CoV-2 est la glycoprotéine d’enveloppe utilisée pour la production de lentivirus pseudotypés non réplicatifs du SRAS-CoV-2.

Brièvement, les cellules d’emballage (HEK293T) ont été co-transfectées avec les trois plasmides différents à l’aide de méthodes standard. Après 48 h, le surnageant contenant les PV a été récolté, filtré et stocké à -80 °C. L’infectiosité des PV du SRAS-CoV-2 a été testée en étudiant l’expression du gène rapporteur (luciférase) dans une lignée cellulaire cible 48 h après l’infection. Plus la valeur des unités de luminescence relative (RLU) est élevée, plus le taux d’infection/transduction est élevé. De plus, les PV infectieux ont été ajoutés aux échantillons de sérum dilués en série pour étudier le processus de neutralisation de l’entrée des pseudovirus dans les cellules cibles, mesuré par la réduction de l’intensité du RLU : des valeurs inférieures correspondant à une activité neutralisante élevée.

Introduction

Les virus pseudotypés (PV) sont des outils moléculaires utilisés en microbiologie pour étudier les interactions hôte-virus et pathogène-pathogène 1,2,3,4. Les PV sont constitués d’une partie interne, le noyau viral qui protège le génome viral, et d’une partie externe, les glycoprotéines d’enveloppe à la surface du virus qui définissent le tropisme⁵. Un pseudovirus est incompétent en matière de réplication dans la cellule cible car il ne contient pas toute l’information génétique nécessaire pour générer de nouvelles pa....

Protocole

Le présent protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Université de Vérone (protocole d’approbation numéro 1538) et suit les directives de celui-ci. Le consentement écrit éclairé des sujets humains participant à l’étude a été obtenu. Des échantillons de sang total ont été prélevés sur des volontaires du personnel de santé qui étaient en train de recevoir des vaccins contre le SRAS-CoV-2. Ces échantillons ont été prélevés dans des tubes en plastique contenant des anticoagulants pour l’isolement ultérieur du sérum¹⁵.

Tous les processus suivants doivent être effectués dans une hotte biologique de classe 2, tr....

Discussion

Bien que l’utilisation d’un virus de type sauvage simule l’infection réelle, les PV lentiviraux sont une option plus sûre pour étudier les mécanismes associés à l’entrée virale et à l’infection sans les exigences de sécurité strictes nécessaires pour travailler avec des virus pathogènes ^4,20,21. Les PV sont composés d’un noyau viral défectueux en réplication entouré de la glycoprotéine d’enveloppe .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	SARSTEDT	83 1826
6-well plate	SARSTEDT	83 3920
96-well plate	SARSTEDT	8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merck	10403892
Black Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium	SIGMA-ALDRICH	D6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)	AUROGENE	AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum	AUROGENE	AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7	graphpad dotmatics	NA	In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine	AUROGENE	AU-X0550-100
Luminometer - Victor3	Perkin Elmer	HH35000500	In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer'
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium'
p8.91 packaging plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin	AUROGENE	AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)	SIGMA-ALDRICH	408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)	Addgene	145839	This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid	Addgene	pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6066759	In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x	AUROGENE	AU-L0949-100