Système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour un système automatisé de culture cellulaire. Ce système de culture automatisé réduit la main-d’œuvre et profite aux utilisateurs, y compris les chercheurs qui ne sont pas familiers avec la manipulation des cellules souches pluripotentes induites (iPS), de l’entretien des cellules iPS à la différenciation en différents types de cellules.

Résumé

On s’attend à ce que les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) à capacité infinie d’auto-prolifération aient des applications dans de nombreux domaines, notamment l’élucidation de pathologies de maladies rares, le développement de nouveaux médicaments et la médecine régénérative visant à restaurer les organes endommagés. Malgré cela, la mise en œuvre sociale des HIPc est encore limitée. Cela s’explique en partie par la difficulté de reproduire la différenciation dans la culture, même avec des connaissances avancées et des compétences techniques sophistiquées, en raison de la grande sensibilité des CSPi aux changements environnementaux infimes. L’application d’un système de culture automatisé peut résoudre ce problème. On peut s’attendre à des expériences avec une reproductibilité élevée, indépendamment des compétences d’un chercheur, selon une procédure partagée entre différents instituts. Bien que plusieurs systèmes de culture automatisés capables de maintenir les cultures iPSC et d’induire une différenciation aient déjà été développés, ces systèmes sont lourds, volumineux et coûteux car ils utilisent des bras robotiques humanisés et multi-articulés. Pour améliorer les problèmes ci-dessus, nous avons développé un nouveau système utilisant un système simple de glissière sur l’axe x-y-z, ce qui lui permet d’être plus compact, plus léger et moins cher. De plus, l’utilisateur peut facilement modifier les paramètres du nouveau système pour développer de nouvelles tâches de manutention. Une fois qu’une tâche est établie, il suffit à l’utilisateur de préparer l’iPSC, de fournir à l’avance les réactifs et les consommables nécessaires à la tâche souhaitée, de sélectionner le numéro de la tâche et de spécifier l’heure. Nous avons confirmé que le système pouvait maintenir les cellules iPS dans un état indifférencié à travers plusieurs passages sans cellules nourricières et se différencier en différents types de cellules, y compris les cardiomyocytes, les hépatocytes, les progéniteurs neuronaux et les kératinocytes. Le système permettra des expériences hautement reproductibles dans tous les établissements sans avoir besoin de chercheurs qualifiés et facilitera la mise en œuvre sociale des hiPSC dans un plus large éventail de domaines de recherche en diminuant les obstacles à de nouvelles entrées.

Introduction

Cet article vise à fournir des procédures de manipulation réelles et détaillées pour un système automatisé de culture de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi), que nous avons produit en collaboration avec une entreprise, et à montrer des résultats représentatifs.

Depuis la publication de l’article en 2007, l’iPSC a attiré l’attention dans le monde entier¹. En raison de sa plus grande caractéristique de pouvoir se différencier en n’importe quel type de cellule somatique, il devrait être appliqué dans divers domaines tels que la médecine régénérative, l’élucidation des causes des maladies incurables

Protocole

Le comité d’éthique de l’Université de médecine du Kansai a approuvé la production et l’utilisation de cellules iPS saines dérivées de volontaires nommées KMUR001 (approbation n° 2020197). Le donneur, qui a été ouvertement recruté, a donné son consentement formel et éclairé et était d’accord avec l’utilisation scientifique des cellules.

REMARQUE : L’interface actuelle (le logiciel spécial nommé « ccssHMI » fonctionnant sous le système d’exploitation Windows XP) est l’écran de fonctionnement fondamental. Sous l’interface susmentionnée, une série d’onglets sont organisés, permettant aux utilisateurs de lancer diverses opérations.

Discussion

Une étape critique du protocole est que si un utilisateur trouve des défauts, cliquez sur le bouton d’annulation, d’arrêt ou de réinitialisation à tout moment et recommencez à partir de la première étape. Le logiciel peut éviter les erreurs humaines, y compris la double réservation, l’ouverture des portes pendant que les tâches du système sont actives et le manque de réapprovisionnement. Un autre point critique pour une différenciation réussie et efficace en la cellule somatique souhaitée est la sé.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% bovine serum albumin fraction V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
10 cm plastic plates	Corning Inc., NY, United States	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinin  mouse	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenine	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumin  rabbit	Dako	A0001
All-trans retinoic acid	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Automated culture system	Panasonic
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Bovine serum albumin	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, United States #HY-10182	252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Human keratinocyte medium
Dexamethasone	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Canada	13071-60-8	rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer	CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorphin	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.	12634010
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum	Biowest, FL, United States	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.MF
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  goat	Santacruz	6556
Hydrocortisone	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate	Merck	H2882
iMatrix511 Silk	Nippi Inc., Tokyo, Japan	892 021	Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Keratin 1  mouse	Santacruz	376224
Keratin 10  rabbit	BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		Patient-derived iPSCs
Knockout serum replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate	A8960, Merck	A8960
Leibovitz’s L-15 medium	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.	354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin mouse	Santacruz	23927
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament  rabbit	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Göttingen, Germany	05-100-1A	cell culture medium
Oct 3/4  mouse	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan	14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Recombinant human albumin	A0237, Merck, Darmstadt, Germany	A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632	Sellec Inc., Tokyo, Japan	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	undifferentiated hiPSCs
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
Sodium L-ascorbate	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mouse	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokyo, Japan	AK02	cell culture medium
TnT rabbit	Abcam	ab92546
TRA 1-81 mouse	Millipore	MAB4381
Triiodothyronine	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM express enzyme	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States	12604013
Trypan blue solution	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	20577-34
Tryptose phosphate broth	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, United Kingdom	5148
β  Tublin  mouse	Promega	G712A