Technique de visualisation 3D pour le remodelage osseux dans un modèle murin d’expansion de suture

Résumé

Ce protocole présente un modèle murin standardisé d’expansion de suture et une méthode de visualisation 3D pour étudier les changements mécanobiologiques de la suture et le remodelage osseux sous charge de force de traction.

Résumé

Les sutures craniofaciales jouent un rôle crucial au-delà d’être des articulations fibreuses reliant les os craniofaciaux ; Ils servent également de niche principale pour la croissance des os calvaires et faciaux, abritant des cellules souches mésenchymateuses et des ostéoprogéniteurs. Comme la plupart des os cranio-faciaux se développent par ossification intramembraneuse, les régions marginales des sutures agissent comme des points d’initiation. En raison de cette importance, ces sutures sont devenues des cibles intrigantes dans les thérapies orthopédiques telles que l’expansion de la voûte crânienne assistée par ressort, l’expansion maxillaire rapide et la traction maxillaire. Sous l’effet de la force de traçage orthopédique, les cellules souches de suture sont rapidement activées, devenant une source dynamique de remodelage osseux pendant l’expansion. Malgré leur importance, les changements physiologiques au cours des périodes de remodelage osseux restent mal compris. Les méthodes de coupe traditionnelles, principalement dans le sens sagittal, ne capturent pas les changements globaux qui se produisent dans l’ensemble de la suture. Cette étude a permis d’établir un modèle murin standard pour l’expansion de la suture sagittale. Pour visualiser pleinement les changements de remodelage osseux après l’expansion de la suture, la méthode d’élimination des tissus PEGASOS a été combinée avec une coloration EdU à montage complet et un double marquage chélateur du calcium. Cela a permis de visualiser des cellules hautement proliférantes et la formation de nouveaux os sur l’ensemble des os calvaires après l’expansion. Ce protocole offre un modèle murin standardisé d’expansion de suture et une méthode de visualisation 3D, mettant en lumière les changements mécanobiologiques dans les sutures et le remodelage osseux sous charge de force de traction.

Introduction

Les sutures craniofaciales sont des tissus fibreux qui relient les os craniofaciaux et jouent un rôle essentiel dans la croissance et le remodelage des os craniofaciaux. La structure de la suture ressemble à une rivière, fournissant un flux de ressources cellulaires pour nourrir et construire la « berge de la rivière », connue sous le nom de fronts ostéogéniques, qui contribuent à la formation des os craniofaciaux via l’ostéogenèse intramembraneuse¹.

L’intérêt pour les sutures craniofaciales a été motivé par les besoins cliniques de comprendre la fermeture prématurée des sutures crâniennes et le dysfonctionnement des sutures faciales, qui peuvent entraîner des déformations craniofaciales et même des conditions potentiellement mortelles chez les enfants. La suturectomie ouverte est couramment utilisée dans le traitement clinique, mais un suivi à long terme a montré une récidive de réossification incomplète chez certains patients². La craniotomie mini-invasive assistée par ressorts d’expansion ou la craniectomie endoscopique peut constituer une approche plus sûre pour préserver la suture potentielle plutôt que de jeter les tissus³. De même, les thérapies orthopédiques telles que les masques faciaux et les appareils d’expansion ont été largement utilisées pour traiter l’hypoplasie sagittale ou maxillaire horizontale, certaines études étendant la limite d’âge pour traiter les patients adultes via des expanseurs palatins assistés par minivis ^4,5,6. De plus, la régénération des sutures crâniennes avec des cellules souches mésenchymateuses (CSM) combinées à des matériaux biodégradables est une thérapie potentielle à l’avenir, offrant une nouvelle direction pour le traitement des maladies connexes⁷. Cependant, le processus de fonction ou le mécanisme de régulation des sutures reste insaisissable.

Le remodelage osseux consiste principalement en un équilibre entre la formation osseuse menée par les ostéoblastes et la résorption osseuse effectuée par les ostéoclastes, où la différenciation ostéogénique des cellules souches stimulée par des signaux mécaniques joue un rôle important. Après des décennies de recherche, il a été constaté que les sutures craniofaciales sont des niches de cellules souches mésenchymateuses hautement plastiques⁸. Les cellules souches de suture (SuSC) sont un groupe hétérogène de cellules souches, appartenant aux cellules souches mésenchymateuses (CSM) ou aux cellules souches osseuses (CSS). Les SuSCs sont marqués in vivo par quatre marqueurs, dont Gli1, Axin2, Prrx1 et Ctsk. Les SuSCs Gli1⁺ , en particulier, ont strictement vérifié les caractéristiques biologiques des cellules souches, non seulement en présentant une forte expression des marqueurs MSC typiques, mais aussi en démontrant un excellent potentiel ostéogénique et chondrogénique⁹. Des recherches antérieures ont montré que les SuSC Gli1⁺ contribuent activement à la formation de nouveaux os sous l’effet de la force de traction, les identifiant comme la source de cellules souches de suture soutenant l’ostéogenèse de distraction¹⁰.

Dans le passé, les caractéristiques mécaniques étendues des cellules souches ont été étudiées in vitro via Flexcell, la courbure en quatre points, le système de chargement par micro-aimant, etc. Bien que des cellules mésenchymateuses dérivées de sutures crâniennes de souris aient été identifiées in vitro¹¹ et que des cellules souches mésenchymateuses de suture humaine aient également été isolées récemment¹², la réponse biomécanique des cellules de suture reste incertaine dans le système in vitro. Pour étudier plus en détail le processus de remodelage osseux, un modèle d’expansion de suture basé sur la culture d’organes de calvaria isolés a été établi, ouvrant la voie à l’établissement d’un modèle d’expansion de suture in vivo utile ^1,13. Les lapins¹⁴ et les rats¹⁵ ont été les animaux les plus utilisés dans la recherche fondamentale pour l’expansion des sutures. Cependant, les souris sont des modèles animaux préférés pour explorer les maladies humaines en raison de leur génome hautement homologue avec celui des humains, de leurs nombreuses lignées de modification génétique et de leur forte capacité d’hybridation reproductive. Les modèles murins existants d’expansion de la suture crânienne reposent généralement sur des fils à ressort orthodontiques en acier inoxydable pour appliquer une force de traction à la suture sagittale^16,17. Dans ces modèles, deux trous sont percés de chaque côté des os pariétaux pour fixer le dispositif d’expansion, et les fils sont intégrés sous la peau, ce qui peut affecter le mode d’activation cellulaire.

En ce qui concerne la méthode de visualisation, l’observation bidimensionnelle des tranches dans la direction sagittale est généralement adoptée depuis des décennies. Cependant, étant donné que le remodelage osseux est un processus dynamique tridimensionnel complexe, l’obtention d’informations tridimensionnelles complètes est devenue un besoin urgent. C’est pour répondre à cette exigence que la technique de transparence tissulaire PEGASOS a vu le jour^18,19. Il offre des avantages uniques pour la transparence des tissus durs et mous, permettant de reproduire l’ensemble du processus de remodelage osseux dans un espace tridimensionnel.

Pour acquérir une compréhension plus profonde et plus complète des changements physiologiques dans les périodes de remodelage osseux, un modèle de souris standard d’expansion de suture sagittale avec un réglage à ressort entre les supports faits à la main a été établi¹⁰. Grâce à une procédure normalisée de gravure et de collage à l’acide, le dispositif d’expansion pourrait être fermement lié à l’os crânien, générant une force de traction perpendiculaire à la suture sagittale. De plus, la méthode d’élimination des tissus PEGASOS a été appliquée après le double marquage de l’os minéralisé après l’expansion afin de visualiser pleinement les changements de modélisation osseuse après l’expansion de la suture.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales décrites ici ont été approuvées par le Comité de protection des animaux du Neuvième Hôpital populaire de Shanghai, École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (SH9H-2023-A616-SB). Des souris mâles C57BL/6 âgées de 4 semaines ont été utilisées dans cette étude. Tous les instruments utilisés ont été stérilisés avant l’intervention.

1. Préparation du modèle d’expansion de suture

1. Préparation de deux supports de rétention.
   1. Utilisez du fil australien de 0,014'' ou du fil d’acier inoxydable (voir le tableau des matériaux) pour faire une boucle hélicoïdale avec une pince à fil léger. Le diamètre de la boucle est de 2 mm, et la queue de 1 mm est réservée sur les deux côtés (Figure 1A).
   2. Stérilisez les fils et les supports pour la chirurgie dans un autoclave, un stérilisateur à plasma ou un stérilisateur à froid approprié (par exemple, le glutaraldéhyde).
2. Préparation des ressorts.
   1. Préparez des ressorts en acier inoxydable personnalisés.
      REMARQUE : Le ressort de pression avec un diamètre de fil de 0,2 mm, un diamètre extérieur de 1,5 mm, un intervalle de 1 mm et une longueur de 7 mm est utilisé dans cette étude (Figure 1B). Chaque compression par ressort de 1 mm permet d’obtenir une poussée d’environ 30 g.
   2. Coupez le ressort à une longueur disponible avant de le régler. Confirmez la force du ressort spécialisé avant l’expérience.
      REMARQUE : Les tailles des ressorts varient tant que l’amplitude de la force est la même dans les expériences parallèles. La force est mesurée à l’aide d’un instrument d’essai uniaxial de table ou d’un petit banc d’essai électronique (voir le tableau des matériaux) si les conditions sont limitées. Le changement de longueur est évalué à l’amplitude de la force (Figure 1C-E). Notamment, il est nécessaire de modifier la valeur de charge de la force du ressort en fonction de l’âge, de l’état osseux de la souris et des objets de recherche.
   3. Préparez un fil australien droit ou un fil d’acier droit de 7 mm de longueur et fabriquez deux feuilles de papier de 2 mm de diamètre qui serviront de barrières (figure 1F).

2. Chirurgie d’expansion de la suture sagittale

1. Anesthésie : Anesthésier les souris avec de la tilétamine (25 mg/kg), du zolazépam (25 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg). Dans le même temps, appliquez une pommade ophtalmique stérile sur les yeux pour éviter le dessèchement des cornées. Jugez de la profondeur de l’anesthésie des souris via un pincement des orteils.
   REMARQUE : Les caractéristiques suivantes indiquent que la souris est anesthésiée correctement : respiration lente et régulière, faiblesse des membres, relaxation musculaire, disparition du réflexe d’acupuncture cutané et du réflexe des paupières, ainsi qu’un réflexe cornéen plus faible.
2. Enlèvement et désinfection de la fourrure : Enlevez soigneusement la fourrure sur le dessus de la tête avec une crème dépilatoire ; Évitez de vous toucher les yeux. Peu de temps après, utilisez une alternance de doses d’iodophor et d’alcool à 75 % pour désinfecter le site chirurgical. Administrer du méloxicam (1 mg/kg) comme analgésie aux souris par injection sous-cutanée.
3. Fixation de la position du corps : Placez la souris allongée sur le devant et utilisez des rubans chirurgicaux pour fixer les membres sur la table d’opération.
4. Lambeau de cuir chevelu ouvert : Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour effectuer un lambeau arqué le long du cuir chevelu près du cou de la souris, exposant complètement la suture sagittale et le crâne environnant. Après cela, fixez le lambeau du cuir chevelu avec une suture 6-0 sur la table d’opération.
5. Collez les supports de rétention après la gravure à l’acide.
   1. Séchez le crâne et gravez-le avec de l’acide phosphorique à 37 % pendant 20 s, puis utilisez une solution saline normale pour nettoyer la gravure à l’acide (figure 2A). Un résidu crayeux sera évident après avoir séché le crâne avec l’ampoule de pipette en caoutchouc.
   2. Cimentez les deux supports (préparés à l’étape 1.1) de part et d’autre des os pariétaux à 3 mm des sutures sagittales avec un adhésif photopolymérisable (Figure 2B).
6. Réinitialisez le lambeau du cuir chevelu.
   1. Remettez manuellement le lambeau du cuir chevelu en place (Figure 2C). Étiquetez la position des supports, découpez deux petits trous dans le cuir chevelu à la position correspondante des supports de rétention bilatéraux, puis réinitialisez le cuir chevelu lambeau.
   2. En même temps, passez les petites boucles dans les trous pour exposer la surface de la peau. Suturez l’incision incurvée avec une suture 6-0 (Figure 2D). Un à trois jours sont alloués pour la récupération de la peau. Administrer du méloxicam (1 mg/kg) aux souris par injection sous-cutanée toutes les 24 h pendant 1 à 3 jours.
      REMARQUE : Après la chirurgie, vérifiez quotidiennement l’activité du cuir chevelu de la souris et si les supports tombent. Il existe différents types de peau en matière de couleur et d’épaisseur ; Le cuir chevelu sain conservera la couleur d’origine et les bords de la peau fusionneront progressivement après la suture. Si une infection du cuir chevelu est détectée ou si le dispositif chirurgical est tombé, retirez la souris de l’étude et euthanasiez-la.
7. Installez le ressort et le fil guide.
   1. Coupez le ressort 1 mm plus long que la distance entre les deux supports.
   2. Comprimez le ressort de pression sélectionné et placez-le entre les petites bobines des deux côtés.
   3. Passez le fil d’acier inoxydable à travers les petites bobines et le ressort, et relâchez le ressort pour obtenir une poussée de départ d’environ 30 g.
   4. Vérifiez que le cuir chevelu sous la zone à ressort de la souris n’est pas compressé.
   5. Après avoir vérifié que le collage est ferme sans aucun desserrement, collez deux bouts de papier entre le ressort et les supports avec un adhésif photopolymérisable afin de mettre en place des barrières aux deux extrémités du ressort (Figure 2E,F).

3. Double marquage des os minéralisés

1. Préparation de la solution mère.
   1. Préparez une solution de dilution avec de l’eau distillée contenant 0,9 % de NaCl et 2 % de NaHCO₃.
   2. Utiliser la solution diluante pour préparer 20 mg/mL de complexe d’alizarine dihydraté et 10 mg/mL de calcéine (voir le tableau des matériaux).
   3. Ajustez le pH à 7,4 à l’aide d’un appareil de mesure du pH. Rincez la sonde de pH entre les mesures pour garantir des lectures précises.
   4. Mettez le colorant dans un récipient stérile et conservez-le au réfrigérateur à 4 °C ; Le papier d’aluminium est utilisé pour empêcher la lumière d’entrer.
2. Préparez la solution de travail. Avant l’injection, diluer la solution mère à 1 mg/mL pour le calcium et à 2 mg/mL pour le complexe d’alizarine dihydraté à l’aide d’une solution de dissolution.
3. Injecter par voie intrapéritonéale 5 mg/kg de vert de calcéine et 20 mg/kg de rouge d’alizarine à deux moments pour marquer les os minéralisés et analyser les changements entre deux temps. En règle générale, prélever les échantillons 12 à 14 h après l’injection.
   REMARQUE : Réchauffez les colorants avant l’injection et assurez-vous que le temps d’injection n’est pas inférieur à 3 minutes. L’intervalle d’injection dépend du temps d’expansion. Dans cette étude, le rouge d’alizarine et le vert de calcéine ont été injectés pendant la nuit (O/N) avant l’expansion et O/N avant le prélèvement, respectivement.
4. Prélever des os calvaires entiers préparés pour la procédure de nettoyage des tissus un jour après la deuxième injection.

4. Coloration EdU

1. Injection intrapéritonéale : Injection intrapéritonéale d’EdU 2 h avant d’euthanasier les souris (selon les protocoles approuvés par l’établissement). La dose est de 1 mg/10 g de poids corporel.
2. Préparation du cocktail d’étiquetage : Mélanger une solution saline tamponnée Tris (100 mmol/L final, pH 7,6), CuSO₄ (4 mmol/L final), de l’azoture de sulfocyanine 3 (2 à 5 μmol/L final) et de l’ascorbate de sodium (100 mmol/L final, frais à chaque utilisation) (voir le tableau des matériaux).
3. Coloration EdU à montage complet : Après l’étape de décoloration des tissus dans la méthode d’élimination des tissus PEGASOS (étape 7), mettez les échantillons dans le cocktail d’étiquetage pendant 1 jour à température ambiante (RT).

5. Imagerie par micro-tomodensitométrie

1. Fixation et stockage des tissus : Fixez les os calvaires dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à 4 °C O/N et stockez-les dans du PFA à 0,5 % avant la numérisation.
2. Balayage et analyse : Scannez les échantillons à l’aide d’un système d’imagerie par microtomodensitométrie (μCT) à haute résolution et d’une taille de voxel de 7 μm.

6. Préparation de la solution de travail pour le nettoyage des tissus PEGASOS

1. Polyformaldéhyde (PFA) à 4 % : Dissoudre 4 g de poudre de PFA dans 1× PBS à 100 mL.
2. Solution de perfusion cardiaque : 0,02 % d’héparine, c’est-à-dire 20 mg de poudre d’héparine dissoute dans 1× PBS à 100 mL ; on peut aussi utiliser 0,05 mol/L d’EDTA, c’est-à-dire 0,05 mol d’acide éthylène-diamine tétraacétique (EDTA) (voir Tableau des matières), dissous dans une solution aqueuse déminéralisée jusqu’à un volume total de 1 L.
3. Solution de décalcification : 0,5 mol/L d’EDTA, c’est-à-dire 0,5 mol d’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), dissous dans une solution aqueuse déminéralisée pour un volume total de 1 L.
4. Solution de décoloration : 25 % de Quadrol, soit 250 mL de Quadrol (N, N, N', N'- Tetrakis (2-Hydroxypropyl) éthylènediamine) (voir le tableau des matériaux) dissous dans de l’eau déminéralisée pour un volume total de 1 L.
   REMARQUE : En raison de la viscosité du Quadrol, il peut être chauffé à 60 °C pour augmenter sa fluidité avant la configuration.
5. Solution dégraissante : 30 %, 50 %, 70 % tert-butanol (tB) (voir tableau des matériaux), préparée avec une fraction volumique de l’eau.
   REMARQUE : Étant donné que le tB pur est cristallin à température ambiante, il doit être chauffé à 60 °C jusqu’à ce qu’il se dissolve avant de pouvoir être utilisé. Par la suite, 3 % à 5 % (v/v) de triéthanolamine (TEA) sont ajoutés pour réguler le pH de la solution >9,5.
6. Solution de déshydratation : solution TB-PEG, 70 % tB + 27 % de PEG-MMA + 3 % de Quadrol (v/v), dans laquelle le PEG-MMA est du méthacrylate de poly (éthylène glycol) méthyl éther d’un poids moléculaire moyen de 500 (poly (éthylène glycol) méthacrylate 500, PEG-MMA 500) (voir tableau des matériaux).
7. Solution transparente : solution BB-PEG, 75 % BB + 22 % de PEG-MMA + 3 % de Quadrol (v/v), où BB est du benzoate de benzyle (BB).

7. Transparence des os calvaires avec la méthode PEGASOS

1. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale d’anesthésiques (étape 2.1) et évaluer la profondeur d’anesthésie de la souris par la réaction de pincement pour s’assurer qu’il n’y a pas de réaction de résistance avant la perfusion cardiaque.
2. Effectuer la perfusion et la fixation cardiaques.
   1. Tenez l’abdomen de la souris vers le haut, fixez les membres avec du ruban adhésif et coupez soigneusement le long de la circonférence du thorax pour l’exposer complètement.
   2. Immédiatement après avoir fait une petite incision dans l’oreillette droite avec des ciseaux ophtalmiques, insérez une aiguille de perfusion 22 G à l’apex du ventricule gauche.
      REMARQUE : Seule la pointe de l’aiguille est insérée pour éviter d’endommager la valve cardiaque par une insertion excessive. Sinon, le liquide de perfusion cardiaque pénètre dans la circulation pulmonaire, affectant l’effet de perfusion de la circulation systémique.
   3. Insérez le liquide de perfusion cardiaque de 30 à 50 ml (étape 6.2) dans la seringue. On peut voir que le foie devient progressivement pâle à partir du rouge vif.
   4. Une fois que le liquide d’écoulement de l’oreillette droite devient complètement clair, perfusez une solution de PFA à 4 % dans un volume égal. Le fonctionnement de la perfusion de PFA est effectué dans une hotte ventilée.
   5. Disséquez et séparez les tissus et les organes, et fixez-les pendant la nuit avec 4 % de PFA à 4 °C.
3. Détartrage tissulaire : Pour les échantillons traités par coloration EdU, placer le tissu dur fixé dans une solution d’EDTA à 0,5 mol/L (pH 7,0) (10 mL) dans une table agitée à 37 °C pendant environ 2 jours, et changer le liquide quotidiennement.
   REMARQUE : Sautez le processus de décalcification dans la méthode PEGASOS normalisée pour les os marqués par l’agent chélateur de calcium afin de préserver complètement la signalisation. La décalcification est nécessaire pour traiter les os afin de visualiser la fluorescence endogène ou les signaux immunocolorés de l’ensemble du support.
4. Décoloration des tissus : Placer les os calvaires fixés dans une solution de Quadrol à 25 % (20 ml) dans une table agitée à 37 °C pendant 1 jour, et changer le liquide une fois.
   REMARQUE : Le temps de décoloration est lié à la teneur en hème dans le tissu. Observez la couleur du liquide de traitement, car la profondeur de la couleur représente la nécessité de poursuivre le traitement de remplacement du fluide.
5. Coloration EdU : Rincez les échantillons dans 1× PBS pendant 5 min (trois fois), puis plongez-les dans le cocktail d’étiquetage pendant 1 jour. Après cela, rincez les échantillons dans 1× PBS pendant 1 h (trois fois).
6. Dégraissage et déshydratation des tissus
   1. Placez les tissus dans des solutions à 30 % tB, 50 % tB et 70 % tB dans l’ordre pour effectuer une diminution du gradient sur une table agitée à 37 °C. Placer dans chaque concentration pendant environ 2 h.
   2. Ensuite, déshydrater les échantillons dans une solution TB-PEG pendant 6 h sur une table vibrante à 37 °C.
      REMARQUE : Le temps de traitement ci-dessus peut être augmenté ou diminué en fonction du nombre de tissus.
7. Transparence des tissus : Placer le tissu complètement déshydraté dans une solution de BB-PEG sur une table agitée à 37 °C (2-4 h) jusqu’à ce qu’il soit transparent. Actuellement, les échantillons peuvent être conservés jusqu’à 1 à 2 ans.
   REMARQUE : Après avoir presque complètement nettoyé, ouvrez le couvercle du tube pour exposer les échantillons et le milieu à l’air avec agitation pour améliorer encore la transparence. Cette méthode convient pour améliorer la transparence des tissus et organes individuels, ainsi que de l’ensemble de la tête et du corps des jeunes souris. Cependant, pour la transparence de l’ensemble du corps des souris adultes, les étapes ci-dessus doivent être effectuées à l’aide d’une méthode de perfusion à cycle complet.

8. Imagerie

REMARQUE : La microscopie confocale a été utilisée pour la visualisation 3D de tissus transparents dans cette étude. La microscopie à feuille de lumière est également appropriée pour ce protocole. Plusieurs systèmes d’exploitation ont déjà été vérifiés comme étant disponibles. Ici, un système d’exploitation de microscope confocal laser est pris à titre d’exemple (voir Tableau des matériaux).

1. Selon le manuel d’utilisation, suivez les étapes correctes pour ouvrir l’interface de fonctionnement de la confocale laser et de l’AF LAS. Allumez le laser requis dans différents canaux de prise de vue et ajustez la puissance. Réglez le chemin optique et la longueur d’onde correspondante, 561 nm pour le rouge d’alizarine et 488 nm pour le vert calcéine, qui sont tous utilisés pour le signal EdU selon le cocktail d’étiquetage.
2. Placez les échantillons transparents dans la boîte de Pétri en verre concave qui peut contenir des échantillons épais, des boîtes d’enrobage ou des dispositifs de placement fabriqués par nos soins tels que de la colle imperméable pour immerger les échantillons transparents dans un liquide transparent.
3. Sélectionnez une lentille d’objectif à faible puissance pour localiser rapidement l’échantillon. Faites une vue d’ensemble de l’ensemble du tissu calvaire grâce à la fonction de balayage rapide et trouvez la zone d’intérêt pour l’imagerie.
4. Réglez la puissance de sortie, sélectionnez le mode de numérisation et ajustez d’abord les coefficients de prise de vue (résolution, vitesse de numérisation, facteur de zoom, qualité d’image, bruit de fond moyen, etc.).
   REMARQUE : Généralement, le gain intelligent varie de 500 à 800 (changement de signal et de bruit) ; Le décalage intelligent est aussi proche que possible de 0 tout en garantissant la qualité de l’image (pour réduire le bruit de fond). Lorsque le gain PMT est supérieur à 800 ou que le gain HyD est supérieur à 100 % et que la luminosité est encore insuffisante, l’intensité du laser peut être augmentée de manière appropriée, mais en principe, plus elle est faible, mieux c’est.
5. Définissez la distance axiale Z et le pas Z, qui sont explorés à partir du côté le moins profond de l’organisation transparente ; c’est-à-dire définir les côtés les plus profonds et les moins profonds.
   REMARQUE : Confirmez la classification et la distance de travail pour chaque objectif. Réglez soigneusement la plage Z et n’utilisez pas la distance de travail dépassant la limite de l’objectif sélectionné. Le « z-Galvo » peut être sélectionné lorsqu’une régulation fine est nécessaire.
6. Réglez à nouveau les paramètres de prise de vue et commencez à prendre des photos. Une fois l’opération terminée, fusionnez et traitez les images à l’aide du module multifonctionnel. Enfin, rangez et éteignez l’instrument dans l’ordre indiqué.

Résultats

À l’aide de ce protocole, un modèle murin d’expansion de la suture sagittale a été établi (Figure 1-2). Pour la visualisation 3D des changements de modélisation osseuse après l’expansion de la suture, la méthode d’élimination des tissus PEGASOS a été appliquée à l’ensemble des os calvaires après l’expansion. Après la perfusion, les os calvaires ont été séparés (figure 3A) et le processus PEGASOS ap...

Discussion

Nous avons appliqué un modèle murin standard d’expansion de suture pour observer les changements morphologiques réguliers qui se produisent chaque semaine pendant tout le cycle de remodelage d’un mois¹⁰. Ce modèle est utile pour la recherche sur le remodelage et la régénération de l’os calvaire par l’expansion des sutures calvaires, ainsi que pour l’étude de diverses cellules de suture in vivo. Pour présenter pleinement les résultats de ces recherches, une visualisatio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027