Application de la coloration des mitochondries vivantes dans le tri cellulaire pour purifier les hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Résumé

Les hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes peuvent être purifiés par tri cellulaire, en utilisant une combinaison de coloration de la molécule d’adhésion des cellules leucocytaires activées (ALCAM, également connue sous le nom de CD166).

Résumé

Les cellules souches embryonnaires humaines (SE) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS) ont des applications potentielles en médecine régénérative cellulaire pour traiter les organes gravement malades en raison de leur prolifération illimitée et de leurs propriétés pluripotentes. Cependant, il est difficile de différencier les cellules ES/iPS humaines en types de cellules cibles 100 % pures en raison de leur grande sensibilité à l’environnement. La tumorigenèse après transplantation est causée par des cellules contaminées, proliférantes et indifférenciées, ce qui rend la technologie de haute purification essentielle pour la réalisation en toute sécurité de la médecine régénérative. Pour atténuer le risque de tumorigenèse, une technologie de purification élevée a été développée pour les hépatocytes dérivés de cellules iPS humaines. La méthode utilise le FACS (tri cellulaire activé par fluorescence) en utilisant une combinaison de contenu mitochondrial élevé et du marqueur de surface cellulaire ALCAM (molécule d’adhésion cellulaire leucocytaire activée) sans modification génétique. 97 % ± 0,38 % (n = 5) des hépatocytes purifiés utilisant cette méthode présentaient une expression protéique de l’albumine. Cet article vise à fournir des procédures détaillées pour cette méthode, telle qu’appliquée à la méthode de différenciation bidimensionnelle la plus récente pour les cellules iPS humaines en hépatocytes.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires et pluripotentes induites (ES et iPS, respectivement) sont considérées comme des sources cellulaires prometteuses pour les thérapies régénératives. Cependant, l’efficacité de la différenciation de ces cellules en types de cellules cibles spécifiques peut varier, même en utilisant la même lignée cellulaire, le même protocole et le même expérimentateur 1,2,3,4. Cette variabilité peut être attribuée à la grande sensibilité des cellules ES/iPS humaines à leur environnement. Par conséquent, il est actuellement ....

Protocole

Cette étude a utilisé des cellules iPS humaines obtenues commercialement (souche 253G1) (voir le tableau des matériaux).

1. Maintenance des cellules iPS humaines

1. Maintenir les cellules iPS humaines dans des conditions exemptes de feeder dans un milieu AK02 sur des boîtes de culture recouvertes de 0,25 μg/cm² iMatrix-511 (voir le tableau des matériaux).

2. Différenciation hépatique des cellules iPS humaines dans des cultures 2D

REMARQUE : Reportez-vous à la figure 1A

Discussion

En raison de leurs fonctions dans le métabolisme des nutriments et la détoxification, les hépatocytes possèdent un nombre relativement important de mitochondries par rapport aux autres types de cellules¹⁵. ALCAM fait partie de la superfamille des immunoglobulines et joue un rôle dans l’adhésion et la migration cellulaires. Il est exprimé dans divers types de cellules, notamment les cellules hépatiques, épithéliales, lymphoïdes, myéloïdes, fibroblastiques et neuronales

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
253G1 human iPS cell line	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK inhibitor
Dexamethasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody	R&D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Sodium L-Ascorbate	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptose phosphate broth solution	Sigma-Aldrich	T8159