La combinaison d’une fraction vasculaire stromale isolée mécaniquement et d’un hydrogel de fibrine : un protocole de traitement

Résumé

La fraction vasculaire stromale (SVF) isolée mécaniquement associée à un hydrogel de fibrine offre un support facile et efficace pour des cellules stromales viables dérivées du tissu adipeux pour diverses indications, y compris l’ingénierie tissulaire et/ou la cicatrisation des plaies. Ici, nous présentons la préparation d’une construction mécanique d’hydrogel SVF (mSVF)-fibrine pour la recherche translationnelle et l’application clinique.

Résumé

Le potentiel de régénération des cellules stromales dérivées du tissu adipeux (ASC) a suscité une attention considérable dans la recherche régénérative et translationnelle. Dans le passé, l’extraction de ces cellules du tissu adipeux nécessitait un processus enzymatique en plusieurs étapes, ce qui aboutissait à un mélange cellulaire hétérogène composé de SCA et d’autres cellules, appelées conjointement fraction vasculaire stromale (SVF). Plus récemment, les protocoles d’isolation mécanique SVF (mSVF) prennent moins de temps et contournent les problèmes réglementaires. Nous avons récemment proposé un protocole qui génère des mSVF riches en cellules stromales en combinant émulsification et centrifugation. L’un des problèmes actuels dans l’application mSVF pour l’application de thérapie des plaies est l’absence d’un échafaudage offrant une protection contre les manipulations mécaniques et la dessiccation. Les hydrogels de fibrine se sont avérés être un complément utile dans le transfert cellulaire à des fins de cicatrisation des plaies dans le passé. Dans le présent travail, nous décrivons les étapes de préparation d’une construction d’hydrogel mSVF-fibrine en tant qu’approche novatrice pour la recherche translationnelle et l’application clinique.

Introduction

Au cours des dernières années, la chirurgie plastique régénérative est devenue un pilier supplémentaire de la chirurgie plastique¹. La chirurgie plastique régénérative vise à restaurer les tissus endommagés en transférant des facteurs solubles, des cellules et des tissus prélevés sur le patient pour favoriser la restauration des tissus de manière peu invasive². Les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) ont attiré l’attention en raison de leur capacité à se différencier en plusieurs lignées mésenchymateuses, ce qui en fait un candidat prometteur pour la recherche en médecine régénérative³. Leur profil cytokinique présente des effets angiogéniques, immunosuppresseurs et antioxydants⁴.

Traditionnellement, les ASC étaient isolées du tissu adipeux à l’aide d’une approche enzymatique avec de la collagénase, ce qui donnait une fraction vasculaire stromale (SVF), qui était ensuite cultivée pour obtenir des ASC. Ces technologies de laboratoire sont coûteuses, chronophages et, surtout, soumises à des restrictions réglementaires strictes, ce qui complique la traduction clinique ^5,6,7. En revanche, les protocoles de fraction vasculaire stromale isolée mécaniquement (mSVF) offrent les avantages cliniques non seulement de contourner les problèmes réglementaires, mais aussi de minimiser les risques de contamination ^8,9.

De nombreux protocoles d’isolement mécanique de la SVF ont été décrits¹⁰. Parmi ceux-ci, le protocole de changement publié par Tonnard et al. a attiré le plus d’attention parmi les chirurgiens régénératifs¹¹. La graisse recueillie par les procédures de liposuccion standard, connues sous le nom de lipoaspirations, peut être transférée entre deux seringues portatives attachées à un dispositif de connexion, ce qui donne une forme liquide appelée nanograisse. Les avantages évidents de ces protocoles d’isolement mSVF comprennent la réduction du temps de traitement, un risque minimal de contamination, car l’ensemble de la procédure est effectuée dans un environnement bien contrôlé, et une traduction clinique immédiate possible¹².

Les preuves précliniques et cliniques indiquent que les propriétés de la mSVF, y compris la viabilité cellulaire et les propriétés de cicatrisation des plaies, sont comparables à celles des méthodes d’isolement enzymatique standard¹². Le potentiel de la mSVF dans la promotion de la cicatrisation des plaies chez le rat et la souris a été validé par des études in vivo menées par Chen et al. et Sun et al.13,14. Cependant, il y a un manque de données disponibles concernant la cicatrisation des plaies en milieu clinique. Des résultats prometteurs ont été rapportés lorsqu’un groupe d’étude a effectué une greffe de graisse autologue chez un patient de 83 ans qui avait une plaie avec un implant exposé dans une fracture ouverte du membre inférieur¹⁵. De plus, Lu et al. ont effectué une comparaison entre la mSVF et le traitement des plaies par pression négative dans une cohorte de 20 patients atteints de plaies chroniques¹⁶. Leurs résultats ont révélé que le traitement par mSVF entraînait un taux de cicatrisation plus élevé que le traitement des plaies par pression négative¹⁶. Les deux études mentionnées ont injecté la mSVF seule ou en combinaison avec un gel dans la zone de plaie ciblée^15,16.

Dans le scénario réel, l’application clinique de la mSVF est limitée en raison des taux d’absorption imprévisibles aux sites receveurs^17,18. Les échafaudages promettent un remède à ce problème, car ils aident à la rétention cellulaire, à la vascularisation et à l’intégration dans les tissus environnants 19,20,21. Les hydrogels de fibrine sont un outil couramment utilisé, approuvé par la FDA, utilisé dans les disciplines chirurgicales et s’est avéré être un vecteur efficace de mSVF¹⁹. Le gel de fibrine est un matériau biopolymère qui offre plusieurs avantages pour fonctionner en tant que transporteur cellulaire : il présente une excellente biocompatibilité, favorise la fixation cellulaire et est capable de se dégrader de manière contrôlable 22,24,25. De plus, il présente une réaction inflammatoire et à un corps étranger minime et est facilement absorbé au cours du cours naturel de la cicatrisation des plaies²². Nous pensons que les diverses capacités de régénération des cellules mSVF mentionnées et la combinaison avantageuse avec un hydrogel de fibrine peuvent fournir une approche innovante pour améliorer les processus de cicatrisation des plaies. Dans l’ensemble, cette approche permet une administration topique efficace de cellules mSVF viables. Nous présentons par la présente le protocole qui combine la mSVF avec un hydrogel de fibrine destiné à être appliqué à des fins de cicatrisation des plaies.

Protocole

Cette étude a été réalisée conformément à la Déclaration d’Helsinki. Tous les donneurs adultes ont fourni un consentement éclairé écrit pour permettre l’utilisation ultérieure des échantillons de tissus recueillis. Le protocole suit les lignes directrices du comité d’éthique de la recherche sur les êtres humains de notre établissement.

1. Prélèvement du tissu adipeux

1. Récoltez le tissu adipeux en effectuant une liposuccion standard dans une technique conventionnelle de récolte de graisse décrite dans les publications précédentes^26,27. Assurez-vous d’utiliser une solution tumescente composée de lactate de Ringer régulier et d’épinéphrine dans un rapport de 1 : 200 000.
2. Effectuez la liposuccion avec une canule d’aspiration de 4 mm, sous pression négative et vibration, dans un sac stérile. Transférez immédiatement la graisse récoltée au laboratoire.

2. Isolation mSVF

1. Effectuez les étapes suivantes (sections 2 et 3) dans une hotte de culture cellulaire pour fournir une zone de travail aseptique. Portez une blouse de laboratoire et des gants pour assurer le niveau de sécurité biologique 2.
2. Préparez le milieu de culture : Complétez 500 ml de milieu modifié Dulbecco’s Eagles’s à haute teneur en glucose (DMEM) avec 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS), 5 ml de pénicilline-streptomycine.
3. Transférez le lipoaspirateur dans un tube à centrifuger de 50 ml.
4. Transférez le lipoaspirage dans une seringue Luer-lock stérile de 20 ml et fixez-y un connecteur de 1,4 mm. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’air à l’intérieur de la seringue.
5. Fixez une deuxième seringue Luer-lock de 20 ml sur le côté controlatéral du connecteur de 1,4 mm.
6. Poussez le tissu adipeux d’une seringue à l’autre pour un total de 30 fois.
7. Transférez la graisse émulsionnée dans un tube à centrifuger frais de 50 ml.
8. Centrifuger la graisse émulsionnée à 500 x g pendant 10 min.
9. Après la centrifugation, jetez la couche supérieure huileuse. Ensuite, récupérez la couche mSV centrale purifiée. Transférez-le dans un tube à centrifuger frais de 50 ml et jetez la phase aqueuse.
10. Remplissez le tube à centrifuger avec du milieu de culture (à partir de l’étape 2.2) jusqu’à 40 ml.
11. Placez le tube de centrifugation dans la centrifugeuse et centrifugez-la à nouveau à 500 x g pendant 5 min.
12. Récupérez la couche mSVF résultante et transférez-la dans un nouveau tube à centrifuger de 50 ml.

3. Fabrication de l’hydrogel de fibrine mSVF-fibrine

1. Combinez 100 μL de mSVF avec 10 μL de thrombine (100 U/mL), 10 μL de CaCl₂ (80 mM) et 70 μL d’acide tranexamique (100 mg/mL) dans un tube stérile de 1,5 mL.
2. À l’aide d’une nouvelle pointe de pipette, ajoutez 10 μL de fibrinogène (100 mg/mL) comme dernier composant, peu de temps avant l’application. Attention la polymérisation de l’hydrogel est observée en 10 à 30 s environ.
3. Pour une application clinique, effectuez cette dernière étape peu de temps avant l’administration topique, de préférence au chevet du patient. À des fins d’analyse, transvaser dans une plaque à 12 puits par pipetage.

4. Test de viabilité et histologie

1. Pipeter 200 μL du mélange mSVF-hydrogel de l’étape 3.3 dans un puits d’une plaque à 12 puits.
2. Pipette 100 μL de la collection mSVF (étape 2.12.) dans un puits de contrôle positif.
3. Pipeter 200 μL d’hydrogel de fibrine uniquement dans un puits comme témoin négatif.
4. Placez la plaque à 12 puits dans un incubateur ordinaire à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 30 min.
5. Après ce temps, ajoutez 1 mL de résazurine (bleu alamar, concentration de 10 %, dilué dans un milieu de culture) dans chaque puits.
6. Après l’ajout, incuber la plaque à 12 puits à 37 °C et 5% de CO₂ pendant 24 h.
7. Après 24 h, mesurer la première intensité de fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques multimode d’imagerie cellulaire utilisant une longueur d’onde d’excitation de 555 nm et une longueur d’onde d’émission de 596 nm.
8. Effectuez des mesures consécutives de l’intensité de la fluorescence les jours 3 et 7.
9. Si une évaluation histologique est nécessaire, arrêter l’expérience les jours 1, 3 et 7 et fixer l’hydrogel de fibrine dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 24 h. Après fixation, ajoutez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 1 % et conservez-la à 4 °C.
10. Encastrez les hydrogels dans un composé à température de coupe optimale (OCT) et sectionnez des blocs congelés à 10 μm d’épaisseur avec un cryostat. Teindre les sections avec une solution d’hématoxyline et d’éosine (H&E) selon les protocoles standard²⁸.

Résultats

Dosage de la résine
Nous avons d’abord examiné la viabilité cellulaire in vitro des cellules mSVF. À cette fin, nous avons effectué un test de viabilité cellulaire de la résazurine aux jours 0, 3 et 7. La figure 1 montre la viabilité cellulaire aux jours 0, 3 et 7 d’un total de quatre échantillons. Les valeurs du jour 0 servent de référence et ont été fixées à 100 %. Au jour 3, le témoin positif (mSVF) a montr...

Discussion

L’isolement mécanique de la FVS offre une alternative élégante à l’approche enzymatique traditionnelle et offre un large accès pour une application clinique²⁹. En fait, la mSVF, telle que proposée dans le présent manuscrit, est déjà utilisée en clinique pour le traitement des tissus mous des cicatrices ou en complément des procédures esthétiques³⁰. Le protocole présenté ici fournit une méthode simple pour une administrat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Wellplate	Sarstedt	83.3921
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Biochemica	A1001.0010
50 mL-Falcon	Falcon	352070
Absorbent Towels, Two Pack	Halyard	89701
Alamar blue 25 mL	Invitrogen	DAL1025
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-500G
Biotek Cytation 5	Agilent		Cell Imaging Multimode Microplate Reader
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Cryostat	Microtome
DMEM with 4,5 g/L glucose,with L-Glutamine, with sodium pyruvate	VWR	392-0416
DPBS	Gibco	14190-144
Epinephrin	Sigma-Aldrich	E4250
Fetal Bovine Serum	Biowest	S181H-500
Fibrinogen Human Plasma 100 mg	Sigma-Aldrich	341576-100MG
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Formalin 4%	Formafix	1308069
FSC 22-Einbettmedium, blau	Biosystems	3801481S
Hematoxylin & Eosin Solution	Sigma-Aldrich	H3136 / HT110132
Lactated Ringer’s Solution 1000 mL	B Braun	R5410-01
Mercedes Cannula 4mm	MicroAire	PAL-R404LL
NaCl 0.9%	Bbraun	570160
OCT Embedding Matrix 125 mL	CellPath	KMA-0100-00A
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	10342243
PBS 1%	Sigma-Aldrich	P4474
PenStrep	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Petridish 150mm	Sarstedt	83.1803
Phalloidin-iFluor 488 Reagent	Abcam	ab176753
Sterile Syringe 20 mL Luer	HENKE-JECT	5200-000V0
Sterile Syringe 30 mL Luer-Lock	BD	10521
Thrombin from Human Plasma	Sigma-Aldrich	T6884-100UN
Tranexamic acid	Orpha Swiss	6837093
Tulipfilter 1.2	Lencion Surgical	ATLLLL
Tulipfilter 1.4	Lencion Surgical	ATLLLL