Évaluation de l’effet des médicaments antidiarrhéiques et des extraits de plantes sur Drosophila melanogaster

Résumé

Ici, une méthode est décrite pour nourrir Drosophila melanogaster avec des médicaments et des extraits de plantes et évaluer leur effet sur le tractus gastro-intestinal en analysant les dépôts fécaux des mouches des fruits. Les mouches traitées par des médicaments peuvent être utilisées comme modèle pour d’autres recherches.

Résumé

Pour étudier la physiologie gastro-intestinale humaine, les scientifiques biomédicaux se sont appuyés sur l’utilisation d’organismes modèles. Bien que de nombreux chercheurs aient utilisé des souris comme modèle pour étudier la fonction intestinale, seuls quelques rapports se sont concentrés sur Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Par rapport aux souris, les mouches des fruits présentent de nombreux avantages, tels qu’un cycle de vie court, un entretien simple et rentable et aucun problème éthique. De plus, la physiologie, l’anatomie et les voies de signalisation gastro-intestinales des mammifères sont hautement conservées chez D. melanogaster. Les extraits de plantes sont traditionnellement utilisés pour traiter la diarrhée et la constipation. Par exemple, Psidium guajava (P. guajava) est l’un des agents antidiarrhéiques les plus connus sous les tropiques. Cependant, aucune étude n’a évalué l’effet des médicaments antidiarrhéiques et laxatifs et des extraits de plantes chez D. melanogaster, et on ne sait toujours pas si des effets similaires (par exemple, des dépôts fécaux plus petits, plus concentrés et moins abondants dans le cas des médicaments antidiarrhéiques) peuvent se produire chez les mouches des fruits par rapport aux mammifères. Dans cette étude, un effet antidiarrhéique induit par P. guajava est démontré dans une souche de D. melanogaster qui présente un phénotype diarrhéique. L’échantillonnage des matières fécales produites par les mouches est surveillé à l’aide d’un aliment enrichi en colorant. Ce protocole décrit la méthode utilisée pour préparer les aliments avec des médicaments, évaluer les dépôts fécaux des mouches nourries avec ces préparations alimentaires et interpréter les données obtenues.

Introduction

Le tractus gastro-intestinal (GI), également appelé tube digestif, est responsable de la digestion et de l’absorption des nutriments et de l’excrétion des produits non digérés¹. Le tractus gastro-intestinal est vulnérable à une gamme de troubles qui peuvent causer de l’inconfort, de la douleur et des perturbations dans la vie quotidienne. Les troubles gastro-intestinaux comprennent les douleurs et l’inconfort abdominaux, les ballonnements, les brûlures d’estomac, l’indigestion ou la dyspepsie, les nausées, les vomissements, la diarrhée et la constipation². La diarrhée est le symptôme le plus courant des troubles gastro-intestinaux³, et elle est définie comme une maladie avec au moins trois selles molles et liquides au cours d’une période de 24 heures⁴. La diarrhée est causée par un large éventail d’agents pathogènes, notamment des bactéries, des virus, des parasites, des champignons, et peut également être causée par des médicaments ^5,6. À l’échelle mondiale, la diarrhée continue d’être la deuxième cause de mortalité chez les enfants de moins de 5 ans⁷. Bien que la diarrhée puisse se résoudre d’elle-même, elle peut également indiquer une affection sous-jacente plus grave si elle dure plus de quelques jours.

Pour étudier le tractus intestinal, les chercheurs se tournent vers des modèles animaux tels que des souris, des rats et des porcs ^8,9. Cependant, l’utilisation de ces animaux peut être coûteuse et prendre du temps, car ils nécessitent des installations spécialisées et des considérations éthiques. Des études récentes ont montré que D. melanogaster peut être utilisé comme modèle pour étudier le tractus gastro-intestinal et étudier certains mécanismes tels que le maintien de l’homéostasie régénérative, le développement de la sénescence immunitaire, la perte de la fonction de barrière épithéliale et le déclin de l’homéostasie métabolique^10,11. D. melanogaster, connue sous le nom de mouche des fruits, partage un degré élevé d’homologie génétique avec les humains ; On pense qu’environ 75 % des gènes de la maladie humaine ont un homologue fonctionnel chez la mouche¹². Ils ont également un système digestif simple composé d’un intestin antérieur, d’un intestin moyen et d’un intestin postérieur¹³. D. melanogaster est facile à cultiver en laboratoire et peut être génétiquement modifié de différentes manières¹⁴. Par conséquent, l’utilisation de D. melanogaster pour des tests in vivo est un outil puissant qui permet aux chercheurs d’étudier des processus biologiques complexes dans un environnement contrôlé.

Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 80 % des personnes vivant dans les pays en développement utilisent la médecine traditionnelle pour leurs besoins de santé primaires¹⁵. La forte utilisation des plantes médicinales peut s’expliquer par le fait qu’elles sont facilement disponibles, peu coûteuses et ont peu d’effets secondaires¹⁶. Les principales parties de la plante utilisées en phytothérapie comprennent les feuilles, l’écorce, les racines, les graines¹⁷ tandis que les principales méthodes de préparation sont l’infusion, la décoction et la macération¹⁸. Ces remèdes à base de plantes contiennent des substances phytochimiques telles que des alcaloïdes, des terpénoïdes, des flavonoïdes, des stéroïdes, des tanins et des glucides¹⁹, qui ont des effets thérapeutiques sur le corps humain. Les gens utilisent une variété de plantes médicinales pour traiter les troubles gastro-intestinaux tels que la diarrhée, les maux d’estomac et la dysenterie²⁰. Par exemple, Psidium guajava est l’une des plantes les plus couramment utilisées pour traiter la diarrhée dans le monde. Divers tests pharmacologiques et cliniques ont déjà montré son innocuité, ce qui en fait un bon candidat antidiarrhéique à étudier^21,22. Cependant, les principales limites des médicaments à base de plantes sont le manque d’efficacité et d’évaluation de la sécurité, ainsi que le manque d’informations précises et complètes sur la composition des extraits de plantes utilisés²³. Pour valider l’efficacité et l’innocuité des médicaments à base de plantes, une approche systématique impliquant une validation expérimentale et clinique est nécessaire et l’approche doit être étayée par suffisamment de données provenant d’études in vivo et in vitro.

Pour évaluer l’efficacité des remèdes traditionnels dans le traitement de la diarrhée, l’utilisation de souris et de rats a été prédominante au cours des dernières décennies^24,25. En raison des principaux avantages mentionnés précédemment, c’est-à-dire la facilité d’utilisation, l’accessibilité, la réplicabilité, les fonctions absorbantes et digestives conservées entre les mouches et les mammifères, nous proposons d’utiliser D. melanogaster comme modèle pour évaluer l’activité antidiarrhéique des plantes. Le phénotype diarrhéique de D. melanogaster peut être caractérisé par plusieurs caractéristiques, notamment une abondance accrue de dépôts fécaux, des dépôts de plus grande taille, une coloration plus claire (moins concentrée) et une matière fécale plus élevée²⁶. Ce phénotype peut être quantifié à l’aide de différents paramètres : nombre de dépôts fécaux, surface totale des dépôts, légèreté moyenne et densité optique intégrée totale (IOD). L’IOD total est défini comme la teneur totale en colorant du dépôt, c’est-à-dire la matière fécale totale excrétée²⁷. Auparavant, un test a été développé pour analyser les dépôts fécaux de D. melanogaster^27,28. Dans ce test, le lecteur ultime de bouse (T.U.R.D.) a été utilisé comme outil d’analyse fécale, ce qui permet de vérifier le nombre, la taille et la légèreté des dépôts fécaux et ainsi de surveiller la physiologie intestinale des mouches des fruits. Cependant, cette méthode n’a jamais été appliquée pour évaluer le phénotype diarrhéique chez les mouches. Le gène du peptide de transport ionique (PTI) est un important régulateur endocrinien de la soif et de l’excrétion et combine l’homéostasie de l’eau avec l’alimentation chez D. melanogaster. Dans une étude récente, il a été démontré que la vitesse de transit des aliments dans le tractus gastro-intestinal et la fréquence des événements de défécation étaient diminuées par la surexpression du PTI et augmentées par le knockdown du PTI. Ce dernier phénotype a été décrit comme diarrhéique par les auteurs de cette étude²⁹.

Dans ce protocole, une version modifiée du test des dépôts fécaux est utilisée pour évaluer l’effet d’un agent antidiarrhéique (c.-à-d. l’extrait de feuille de goyave) sur le tractus gastro-intestinal de D. melanogaster en utilisant la souche ITPi comme modèle diarrhéique. L’objectif global de cette méthode est : 1) de fournir une méthode simple et fiable pour évaluer l’effet antidiarrhéique des médicaments et des extraits de plantes, et 2) de permettre la découverte de composés bioactifs responsables de l’effet antidiarrhéique dans les extraits de plantes en appliquant une approche guidée par la bioactivité.

Protocole

1. Préparation de l’extrait de plante

1. Récoltez les feuilles de Psidium guajava L.³⁰ sur un arbre adulte et traitez comme suit : séchez les feuilles dans un four à 40 °C pendant 6 jours, puis séchez-les à l’air libre pendant 6 jours, puis séchez-les à nouveau au four à 40 °C pendant 4 jours, et enfin préparez la poudre de feuilles en broyant les feuilles sèches dans un moulin à broyer ou un moulin à café.
2. Macérer 100 g de poudre séchée dans 1 L d’éthanol à 96% pendant 24 h, en remuant continuellement à l’aide d’un shaker. Soumettre à nouveau le résidu de l’installation au même processus et évaporer les filtrats obtenus à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide à pression réduite (175 mbar) à 40 °C.
3. Dissoudre l’extrait végétal dans de l’éthanol pour obtenir la concentration souhaitée. Déterminez la concentration optimale (à l’aide du protocole décrit ici) en testant une série de concentrations.
   1. Pour les extraits de plantes, testez une plage de concentrations de 100 μg/mL, 1 mg/mL, 10 mg/mL, 100 mg/mL et utilisez ceux qui n’affectent pas le taux de survie de la mouche. Pour les composés purs, tester la gamme de concentrations suivante : 0,05, 0,5, 5 et 50 mM¹².

2. Préparation du milieu alimentaire

1. Mesurez 100 mL d’eau distillée et versez-la dans le bécher avec 4 g de sucre et 0,8 g d’agar-agar (voir tableau des matériaux). Chauffer à 100 °C (en remuant) et maintenir pendant 10 min.
2. Baissez la température à 80 °C, ajoutez 7,4 g de farine et 2,8 g de levure tout en remuant. Chauffer pendant au moins 20 min en remuant toujours et en contrôlant la température qui doit être d’environ 80 °C.
3. Ajouter la solution d’acide moldex-propionique (1 mL de moldex et 0,3 g d’acide propionique bien mélanger). Attendez que la température descende à environ 50 °C, ajoutez la solution d’extrait de plante (1 mg/mL) et 0,5 g de poudre de bleu de bromophénol.
   REMARQUE : Veuillez vous référer à la section 1.3.1 pour plus de détails sur les autres concentrations à tester.
4. Versez les aliments dans les boîtes de Pétri et arrêtez-les lorsque la boîte de Pétri est pleine (Figure 1A). Laisser refroidir les boîtes de Pétri à température ambiante (environ 3 h), puis fermer le couvercle et conserver au réfrigérateur à 4 °C.
   REMARQUE : Les boîtes de Pétri ne doivent pas être conservées au réfrigérateur plus de 2 semaines pour éviter l’évaporation de l’eau.

Figure 1 : Démonstration du procédé expérimental pour l’essai des dépôts fécaux. (A) Image montrant des boîtes de Pétri remplies de milieu alimentaire. Assurez-vous d’avoir suffisamment de nourriture dans la boîte de Pétri, afin qu’aucun espace ne piège les mouches et ne les empêche de se déplacer. Cependant, ne surchargez pas la boîte de Pétri avec de la nourriture afin que la surface puisse être recouverte uniformément. (B) Image de la spatule telle que décrite dans le protocole. (C) Image de l’analyse des dépôts fécaux telle que décrite dans le protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Préparation des mouches

1. Préparez les réservoirs de CO₂ , la soufflette de CO₂ avec des aiguilles, un tampon à mouches, un pinceau et un microscope. La station de vol fournit du CO₂ à la fois au tapis anti-mouches et à la soufflette. Le coussin anti-mouches est utilisé pour trier les mouches, tandis que la soufflette CO₂ est utilisée pour anesthésier les mouches dans les flacons, les bouteilles et les boîtes de Pétri.
2. Normalisez l’âge des mouches en sélectionnant des flacons contenant des pupes (au moins 10) et jetez les mouches adultes du tube en utilisant la méthode suivante. Un par un, retournez les flacons et insérez l’aiguille entre le bouchon en coton et la paroi latérale du flacon. Anesthésiez les mouches adultes avec la soufflette CO₂ jusqu’à ce que toutes les mouches soient endormies sur le bouchon en coton (quelques secondes sont nécessaires pour les anesthésier, et l’action anesthésiante durera quelques secondes après avoir relâché la soufflette). Ouvrez le flacon au-dessus d’une bouteille en verre contenant 70 % d’éthanol et déposez-y les mouches. Fermez le flacon avec le bouchon en coton et conservez-le dans un incubateur à 25 °C avec 60% d’humidité. Réglez le cycle d’éclairage de l’incubateur sur 12 h lumière/12 h obscurité.
3. Après l’incubation (maximum 8 h), triez-les en femelles et mâles vierges au microscope et au fly pad en les retournant sur le dos et en regardant leurs organes génitaux.
   1. Les organes génitaux féminins sont pâles par rapport aux organes génitaux masculins, qui sont de couleur rougeâtre. Les mâles peuvent également être identifiés par la présence de poils foncés, appelés peignes sexuels, sur leur paire de pattes avant. Répartissez les mouches dans deux tubes frais (un pour les mâles et un pour les femelles) et incubez-les pendant 6 à 8 jours à 25 °C.
      REMARQUE : À 25 °C, les femelles restent vierges pendant environ 8 h après l’éclosion.

4. Test de dépôt fécal

1. Étiquetez les boîtes de Pétri avec la souche, le sexe et le médicament correspondants pour éviter toute confusion entre les boîtes de Pétri. Empilez les boîtes de Pétri les unes sur les autres.
2. Prenez les boîtes de Pétri contenant les aliments teints et retournez-les sur le papier buvard pour absorber le liquide supplémentaire. À l’aide d’une spatule (figure 1B), coupez les aliments en 12 parties égales, puis utilisez la spatule pour mettre une tranche dans une boîte de Pétri vide.
   REMARQUE : Selon le nombre de répétitions, le nombre de tranches à couper peut être augmenté jusqu’à 20 par boîte de Pétri. Chaque tranche doit être de la même taille.
3. Anesthésiez les mouches avec du CO₂ jusqu’à ce que toutes les mouches soient endormies sur le bouchon en coton. Transférez six mouches saines dans chaque boîte de Pétri (Figure 1C) et fermez immédiatement le couvercle, puis placez-les dans l’incubateur (25 °C, 60 % d’humidité, 12 h de lumière / 12 h d’obscurité).
4. Pour vous assurer que les mouches ne s’échappent pas de la boîte de Pétri pendant l’expérience, fixez les couvercles supérieur et inférieur de la boîte de Pétri avec du ruban adhésif. Pour chaque groupe d’essai, préparez six boîtes de Pétri répétées (au moins).
5. Après avoir laissé les mouches se cabrer pendant 24 h, utilisez du CO₂ pour les anesthésier, transférez les mouches dans un récipient rempli d’éthanol à 70 % et jetez toute nourriture restante.
6. Conservez les boîtes de Pétri et passez à l’étape 5.

5. Quantification des boîtes de Pétri

1. Définissez un dossier sur l’ordinateur et renommez-le, en incluant le nom de la souche expérimentale, le sexe des mouches et le type de médicaments utilisés. Dans ce dossier, créez des sous-dossiers nommés Original, Découpe et Analyse.
2. Scannez les boîtes de Pétri à l’aide d’un scanner haute résolution avec une résolution optique de 6 400 pixels par pouce (ppp). Scannez les couvercles supérieur et inférieur de chaque boîte de Pétri séparément en les plaçant individuellement au milieu du champ du scanner.
3. Ouvrez l’application installée sur l’ordinateur. Une fenêtre d’accueil s’ouvre sur l’écran de l’ordinateur avec tous les paramètres généraux (Figure 2A).
   REMARQUE : Ne modifiez pas les paramètres avancés. Cette étape n’est valable que pour les utilisateurs qui disposent du même scanner que celui proposé dans la table des matériaux. Veuillez vous référer aux directives si vous utilisez un autre logiciel.
   1. Nommez la boîte de Pétri dans l’application, en incluant le numéro de séquence, le couvercle supérieur ou inférieur, le sexe et le type d’aliment utilisé. Sélectionnez le sous-dossier d’origine défini à l’étape 5.1.
   2. Prévisualisez la boîte de Pétri. Cliquez sur Aperçu en bas de la fenêtre, attendez quelques secondes que le scanner pré-scanne, puis une fenêtre apparaît sur l’écran de l’ordinateur. Déplacez le carré affiché à l’écran pour entourer la boîte de Pétri.
   3. Cliquez sur Scanner en bas à droite de la fenêtre sur l’écran de l’ordinateur, le scan est automatiquement enregistré sous forme d’image dans le dossier de votre choix.
4. Recadrez l’image à l’aide d’une application (par exemple, l’application Fidji open source), afin qu’aucun artefact ou résidu alimentaire ne soit considéré comme un dépôt.
   REMARQUE : Les étapes suivantes ne sont valables que pour les utilisateurs disposant de l’application Fidji. Veuillez vous référer aux directives si vous utilisez un autre logiciel.
   1. Ouvrez l’application Fidji, attendez quelques secondes jusqu’à ce qu’une barre d’outils apparaisse à l’écran.
   2. Faites glisser l’image à recadrer sur la barre d’outils. Sélectionnez la 3e icône Sélections de polygones dans la barre d’outils, recadrez la partie indésirable de la photo (le diagramme circulaire coloré) en cliquant sur l’écran pour marquer un angle autour du graphique circulaire (figures 2B-1,2).
      REMARQUE : Lors de la délimitation de la zone de recadrage dans une image, il est impératif que les images choisies soient connectées de bout en bout de manière transparente.
   3. Cliquez sur Modifier en haut à gauche de la barre, puis sur Remplir/Effacer à l’extérieur (Figure 2B-3).
   4. Pour enregistrer la photo, cliquez sur Fichier en haut à gauche de la barre, puis sur Enregistrer sous, et enfin sur Tiff. Choisissez le sous-dossier Cut set à l’étape 5.1.
      REMARQUE : Lors de l’enregistrement de l’image recadrée, assurez-vous qu’aucun caractère spécial (par exemple, !, &, $, #, _,-,...) ou trop de caractères n’est présent dans le nom de fichier .

Figure 2 : Étapes clés du processus d’analyse des données de l’analyse des dépôts fécaux. (A) Capture d’écran montrant les informations de réglage de l’application de numérisation. (B) Images recadrées à l’aide de l’application Fidji. Assurez-vous qu’aucun artefact et résidu alimentaire n’est considéré comme un dépôt. (C) Capture d’écran montrant à quoi cela ressemble lors de l’ouverture de l’application Excel_merge-v4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Identification des dépôts fécaux à l’aide du lecteur ultime de logiciels open source de fumier

NOTE : L’introduction et l’utilisation du logiciel de lecture ultime des excréments se trouvent dans le fichier supplémentaire 1.

1. Tout d’abord, ouvrez le logiciel T.U.R.D. (Figure supplémentaire 1). Créez une expérience et donnez un nom au document, puis enregistrez-le dans le sous-dossier Analyse défini à l’étape 5.1.
2. Cliquez sur Assiettes , puis sur Ajouter une plaque. Sélectionnez la boîte de Pétri à traiter. Une nouvelle fenêtre apparaît avec les noms des plaques sélectionnées et de nouveaux paramètres. Définissez la taille de bloc, le décalage, la taille minimale et la taille maximale (Figure supplémentaire 2).
3. Pour vérifier que les dépôts fécaux détectés sont les bons, cliquez sur Plaques, puis sur Inspecter les plaques sélectionnées, puis sur Graphiques et sur Afficher les images annotées (Figure supplémentaire 3). Effectuez un zoom avant et regardez les chiffres. S’il n’y a que quelques dépôts qui ne devraient pas être inclus dans l’analyse, désélectionnez les dépôts à exclure (figure supplémentaire 4).
4. Pour chaque nouvelle image à traiter, recommencez à partir de l’étape 6.3.
5. Après avoir analysé les plaques avec le logiciel T.U.R.D., modifiez le nombre de mouches en cliquant sur Non. Mouches (figure 5 supplémentaire).
6. Modifiez le nom du groupe en cliquant sur Plaques > Modifier les groupes > Ajouter, puis sur Colonne Groupe , choisissez le nom du groupe.
7. Exportez les différentes données répliquées séparément en cliquant sur Analyser > statistiques descriptives > Sélectionner un groupe (Figure supplémentaire 6). Conservez tous les fichiers de feuille de calcul (.csv) dans le même dossier.
8. Afin de rassembler tous les fichiers (obtenus à l’étape 6.7) dans une feuille de calcul unique, ouvrez l’application Excel_merge-v4 (Fichier de codage supplémentaire 1), attendez que la phrase suivante apparaisse Sélectionnez le chemin du dossier (avec .csv fichiers) :, puis collez l’adresse du dossier ci-dessus. Par exemple, le chemin d’accès peut être C :\Experiment\Fecal deposit test\, puis cliquez deux fois sur Entrée sur le clavier (Figure 2C). Après cela, un nouveau fichier de feuille de calcul est créé dans le même dossier. Le nouveau fichier de feuille de calcul comprend tous les fichiers exportés dans différentes feuilles.
9. Dans le tableur précédent, ajoutez une autre feuille pour recueillir la moyenne de chaque paramètre de toutes les répliques (utilisez la fonction RECHERCHEV pour traiter les données). Un exemple est donné dans le tableau supplémentaire 1.
10. Analysez la valeur de p.

Discussion

D. melanogaster a été largement accepté comme modèle pour divers processus biologiques en raison de la similitude des gènes entre D. melanogaster et les humains³⁶. L’utilisation de D. melanogaster comme modèle pour l’étude du tractus intestinal est répandue et l’application de T.U.R.D. a été utilisée pour estimer le nombre, la superficie et la quantité de dépôts fécaux. Cependant, la méthode de détection phénotypique n’a pas été utilisée pour évaluer la diarrhée chez les mouches des fruits. Par conséquent, ce protocole introduit une nouvelle méthode pour évaluer grossièrement la présence de diarrhée en détectant les dépôts fécaux.

Les dépôts fécaux sont un indicateur essentiel de la fonction et de la santé du tractus intestinal³⁷. Dans ce contexte, une méthode d’élevage de D. melanogaster sur milieu contenant du médicament est proposée afin d’étudier divers paramètres des dépôts fécaux. En surveillant le nombre de dépôts, il est possible de déterminer la fréquence de la défécation et d’évaluer si un médicament a un impact sur le transit intestinal. La surface totale des dépôts peut être mesurée pour évaluer la concentration et la dilution des matières fécales, ce qui est un facteur important pour déterminer la santé globale du tractus intestinal. De plus, la densité optique totale intégrée (IOD) peut être utilisée pour détecter la quantité totale de matières fécales présentes dans les dépôts. Ce protocole fournit une méthode efficace pour dépister et évaluer les médicaments ainsi que les extraits de plantes qui affectent le tractus intestinal. Lorsque D. melanogaster est utilisé comme organisme modèle, il est possible d’évaluer l’efficacité de médicaments potentiels, ce qui peut aider à accélérer le processus de découverte de médicaments. En appliquant cette méthode sur des extraits de plantes, les chercheurs peuvent aider à valider leur utilisation comme agents antidiarrhéiques.

Il y a plusieurs étapes critiques à prendre en compte lors de l’utilisation de ce protocole pour étudier les dépôts fécaux chez D. melanogaster. Tout d’abord, il est essentiel de calculer la masse nécessaire pour atteindre la concentration souhaitée du médicament dans le milieu. De plus, il est important d’assurer de bonnes conditions de préparation lors de l’ajout du médicament au milieu, car des températures élevées peuvent dégrader le médicament et affecter sa puissance. Deuxièmement, la sélection des mouches femelles est importante dans ce protocole. Il est important d’utiliser des mouches femelles vierges pour éviter les différences de production fécale entre les femelles vierges et accouplées. Par exemple, les taches produites par les femelles vierges sont plus circulaires que les femelles accouplées, et les femelles accouplées ont tendance à excréter plus de matières fécales que les femelles vierges^27,28. Par conséquent, il est recommandé de ramasser les mouches avant 8 h d’éclosion pour s’assurer que toutes les femelles récoltées sont vierges. De plus, les mouches testées doivent être fortes et en bonne santé, car leur santé peut influencer la prise alimentaire et la production fécale. Par exemple, les mouches ayant une forme anormale d’ailes peuvent avoir de la difficulté à obtenir la nourriture. Enfin, pour utiliser T.U.R.D. avec succès, la taille des blocs (pixels) et les paramètres de décalage sont cruciaux. En raison de la différence de contraste de la lumière des images, il peut être nécessaire d’essayer différents réglages pour obtenir la meilleure identification possible des dépôts fécaux.

Bien que la méthode présentée soit efficace, il existe plusieurs limites. L’un d’eux est la précision de la concentration de médicament dans le milieu. Comme le milieu est chauffé pendant la préparation, une partie de l’eau peut s’évaporer, ce qui peut affecter la concentration du médicament. Une autre limitation est le balayage des boîtes de Pétri. Certaines parties des boîtes de Pétri (c’est-à-dire les bords) ne sont pas scannées, ce qui pourrait entraîner une erreur de calcul du total des dépôts fécaux. De plus, les mouches ne produisent pas la même quantité de dépôts fécaux sur les couvercles supérieur et inférieur des boîtes de Pétri. Étant donné qu’ils ont tendance à produire plus de dépôts sur le couvercle inférieur, l’écart-type de l’analyse entre le couvercle supérieur et le couvercle inférieur peut être élevé, ce qui peut affecter la précision des résultats.

À l’aide de ce protocole, les chercheurs peuvent étudier la diarrhée chez D. melanogaster. En modifiant le milieu contenant le médicament, cette méthode peut être utilisée pour cribler les plantes antidiarrhéiques, ce qui offre une nouvelle approche de la découverte de médicaments. La médecine traditionnelle et les produits naturels sont utilisés depuis des siècles pour traiter différentes maladies, y compris les troubles gastro-intestinaux. En utilisant ce protocole pour évaluer l’efficacité des extraits de plantes sur les dépôts fécaux, de nouveaux traitements potentiels pour les troubles du tractus intestinal peuvent être identifiés et une justification scientifique pour leur utilisation comme agents antidiarrhéiques peut être fournie. Cette approche peut apporter une contribution précieuse au domaine de la découverte de médicaments et de l’ethnopharmacologie.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical & Food medium
Agar	Sigma Aldrich	A7002	5 Kg bucket
Bromophenol blue	Sigma Aldrich	34725-61-6	B5525-25G
Corn flour	Nature et Cie	*910007	25 Kg bag
Crofelemer	Napo pharmaceuticals	-	-
Ethanol 96%	-	-	-
Loperamide	Sigma Aldrich	L4762	5 grams
Moldex	VWR	1.06757.5000	5 Kg bag
Propionic acid	Dutscher	409553-CER	1 Liter bottle
Sugar	Pomona EpiSaveurs	52705	1 Kg bag
Yeast	Dutscher	789195	10 Kg bag
Materials
Beaker	DWK LIFE SCIENCE	-	250 mL
Centrifugation tube	Eppendorf	30119401	Eppendorf tubes  5.0 mL
CO2 tank	-	-	-
Erlen Meyer flask	-	-	500 mL (for extraction)
Filter paper grade	Whatman	-	3 mm chr.
Flowbuddy socle	Genesis	-	-
Flugs Narrow Plastic vials	Genesis	49-102	-
Flystuff Blow gun	Genesis	-	-
Flystuff Ultimate Flypad	Genesis	-	-
Flystuff Foot pedal	Genesis	-	-
Forceps	Dumostar	11295-51	-
Graduated cylinder	-	-	100 mL
Inox spatula	-	-	-
Micropipette	Eppendorf	4924000088	Eppendorf Reference 2
Micropipette tip	Eppendorf	30000919	epT.I.P.S. Standard
Narrow Drosophila vials	Genesis	32-120	-
Paintbrush	-	-	-
Petri dish	Greiner	628162	Size: 60 x 15mm
Round-bottom flask	-	-	500 mL (for evaporation)
Thermometer	Avantor	620-0916
Whisk	-	-	-
Equipments
Chiller	HUBER	Minichiller	-
Heating bath	BÜCHI	B-490	-
Heating plate	BIOBLOCK SCIENTIFIC	-	Magnetic stirrer hot plate
Incubator	Memmert	-	HPP110eco
Rotary evaporator	BÜCHI	R-200	-
Scanner	Epson	V850 pro	-
Shaker	Edmund Bühle	KS 10	-
Stereomicroscope binocular	Zeiss	Stemi 305	-
Vacuum pump	VACUUBRAND	PC500 series	-
Vortex mixer	Sigma Aldrich	CLS6776-1EA	Corning LSE vortex mixers
Weighing scale	OHAUS Scout	SKX622	-