Surveillance de l’évolution mécanique des tissus lors de la fermeture du tube neural d’un embryon de poussin

Résumé

Ce protocole a été développé pour surveiller longitudinalement les propriétés mécaniques du tissu de la plaque neurale pendant la neurulation de l’embryon de poulet. Il repose sur l’intégration d’un microscope Brillouin et d’un système d’incubation sur scène, permettant l’imagerie mécanique en direct du tissu de la plaque neurale dans des embryons de poussins cultivés ex ovo .

Résumé

La fermeture du tube neural (NTC) est un processus critique au cours du développement embryonnaire. L’échec de ce processus peut entraîner des anomalies du tube neural, provoquant des malformations congénitales ou même la mort. La NTC implique une série de mécanismes aux niveaux génétique, moléculaire et mécanique. Si la régulation mécanique est devenue un sujet de plus en plus attractif ces dernières années, elle reste largement inexplorée en raison du manque de technologie adaptée pour effectuer des tests mécaniques de tissus embryonnaires 3D in situ. En réponse, nous avons développé un protocole pour quantifier les propriétés mécaniques du tissu embryonnaire de poulet de manière non contactable et non invasive. Ceci est réalisé en intégrant un microscope confocal Brillouin à un système d’incubation sur scène. Pour sonder la mécanique tissulaire, un embryon pré-cultivé est prélevé et transféré dans un incubateur sur scène pour une culture ex ovo . Simultanément, les images mécaniques du tissu de la plaque neurale sont acquises par le microscope Brillouin à différents moments du développement. Ce protocole comprend des descriptions détaillées de la préparation des échantillons, de la mise en œuvre des expériences de microscopie Brillouin, ainsi que du post-traitement et de l’analyse des données. En suivant ce protocole, les chercheurs peuvent étudier longitudinalement l’évolution mécanique du tissu embryonnaire au cours du développement.

Introduction

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales graves du système nerveux central causées par des défaillances de la fermeture du tube neural (NTC) au cours du développement embryonnaire¹. L’étiologie des MTN est complexe. Des études ont montré que le NTC implique une séquence de processus morphogénétiques, y compris l’extension convergente, la flexion de la plaque neurale (par exemple, la constriction apicale), l’élévation du pli neural et enfin l’adhésion du pli neural. Ces processus sont régulés par de multiples mécanismes moléculaires et génétiques ^2,3

Protocole

Le protocole a été approuvé par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Wayne.

1. Préparation expérimentale

1. Utilisez une solution d’éthanol à 70 % pour nettoyer et stériliser les ciseaux et la pince à épiler. Préparez également des pipettes jetables et une seringue.
2. Préparez un milieu de lavage en ajoutant 3,595 g de NaCl à 495 mL d’eau désionisée. Ajoutez ensuite 5 ml de pénicilline-streptomycine (5 U/mL) au milieu. Remplissez une boîte de Pétri de 100 mm avec le produit de lavage et réchauffez-la à 37 °C.
3. Préparez les plats de culture selon la ....

Discussion

Le développement précoce de l’embryon peut être facilement affecté par des perturbations externes. Par conséquent, la plus grande prudence est requise lors de l’extraction et du transfert de l’échantillon. Un problème potentiel est le détachement de l’embryon du papier filtre, ce qui peut entraîner le rétrécissement de la membrane vitelline et entraîner un artefact incliné de la plaque neurale dans l’imagerie Brillouin. De plus, ce rétrécissement peut arrêter le développement de l’embryon. Un.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set