Isolement immunomagnétique des cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire chez la souris

Résumé

Cette étude a permis d’établir une méthode stable et efficace pour l’isolement, la culture et la détermination fonctionnelle des cellules souches CD34⁺ résidentes de la paroi vasculaire (CD34⁺ VW-SC). Cette méthode d’isolement facile à suivre et rapide peut être utilisée par d’autres chercheurs pour étudier les mécanismes potentiels impliqués dans les maladies cardiovasculaires.

Résumé

Les cellules souches et progénitrices résidentes de la paroi vasculaire CD34⁺ (VW-SC) sont de plus en plus reconnues pour leur rôle crucial dans la régulation et la réparation des lésions vasculaires. La mise en place d’une méthode stable et efficace pour cultiver des VW-SC CD34⁺ murins fonctionnels est essentielle pour approfondir l’étude des mécanismes impliqués dans la prolifération, la migration et la différenciation de ces cellules dans diverses conditions physiologiques et pathologiques. La méthode décrite combine le criblage par billes magnétiques et la cytométrie en flux pour purifier les VW-SC CD34⁺ résidents en culture primaire. Les cellules purifiées sont ensuite identifiées fonctionnellement par coloration par immunofluorescence et imagerie Ca²⁺ . En bref, les cellules vasculaires de l’adventice de l’aorte murine et de l’artère mésentérique sont obtenues par fixation par bloc tissulaire, suivie d’une sous-culture jusqu’à ce qu’elle atteigne un nombre de cellules d’au moins 1 × 10⁷. Par la suite, les VW-SC CD34⁺ sont purifiés à l’aide du tri par billes magnétiques et de la cytométrie en flux. L’identification des VW-SC CD34⁺ implique une coloration par immunofluorescence cellulaire, tandis que la multipotence fonctionnelle est déterminée en exposant les cellules à un milieu de culture spécifique pour une différenciation orientée. De plus, la libération interne fonctionnelle de Ca²⁺ et l’entrée externe de Ca²⁺ sont évaluées à l’aide d’un poste de travail d’imagerie disponible dans le commerce dans des cellules chargées de Fura-2/AM exposées à l’ATP, à la caféine ou à la thapsigargine (TG). Cette méthode offre une technique stable et efficace pour isoler, cultiver et identifier les cellules souches CD34⁺ résidentes de la paroi vasculaire, offrant l’opportunité d’études in vitro sur les mécanismes de régulation des VW-SC et le criblage de médicaments ciblés.

Introduction

La paroi vasculaire joue un rôle central dans le développement vasculaire, la régulation homéostatique et la progression des maladies vasculaires. Au cours des dernières années, de nombreuses études ont révélé la présence de diverses lignées de cellules souches dans les artères. En 2004, le groupe du professeur Qingbo Xu a signalé pour la première fois l’existence de cellules souches/progénitrices vasculaires à la périphérie de la paroi vasculaire adulte, exprimant CD34, Sca-1, c-kit et Flk-1¹. Ces cellules souches vasculaires présentent un potentiel de différenciation et de prolifération multidirectionnel. Dans des conditions normales, ils res....

Protocole

Cette étude a été approuvée et les animaux ont été manipulés conformément aux Lignes directrices pour la gestion et l’utilisation des animaux de laboratoire en Chine. La recherche a strictement respecté les exigences éthiques de l’expérimentation animale, avec l’approbation du Comité d’éthique animale (numéro d’approbation : SWMU2020664). Des souris C57BL/6 en bonne santé âgées de huit semaines, des deux sexes, pesant entre 18 et 20 g, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été hébergés au Laboratory Animal Center de la Southwest Medical University (SWMU).

1. Culture en bloc tissulaire d’adventites de l’aorte et des....

Discussion

Cette étude fournit une méthode rapide et pratique pour obtenir des VW-SC CD34⁺ fonctionnels à partir de l’aorte et des artères mésentériques de souris. Les VW-SC CD34⁺ obtenus par cette méthode ont une activité proliférative et des propriétés de différenciation multidirectionnelle. Les récepteurs triphosphate 1,4,5-trisphosphate d’inositol (IP₃Rs), les récepteurs de la ryanodine (RyRs) et les canaux calciques exploités par le stockage médient la libération et l’ent.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023