Isolement de cellules stromales à partir d’organes hématopoïétiques

Résumé

Nous présentons ici des protocoles qui permettent d’isoler des cellules stromales de l’os murin, de la moelle osseuse, du thymus et du tissu thymique humain compatibles avec la multiomique unicellulaire.

Résumé

Le séquençage unicellulaire a permis de cartographier des populations cellulaires hétérogènes dans le stroma des organes hématopoïétiques. Ces méthodologies fournissent une lentille à travers laquelle étudier l’hétérogénéité jusqu’alors non résolue à l’état d’équilibre, ainsi que les changements dans la représentation du type cellulaire induits par des stress extrinsèques ou au cours du vieillissement. Ici, nous présentons des protocoles par étapes pour l’isolement de populations de cellules stromales de haute qualité à partir du thymus murin et humain, ainsi que de l’os et de la moelle osseuse murins. Les cellules isolées par ces protocoles conviennent à la génération d’ensembles de données multiomiques unicellulaires de haute qualité. Les impacts de la digestion des échantillons, de l’appauvrissement de la lignée hématopoïétique, de l’analyse/tri FACS et de la façon dont ces facteurs influencent la compatibilité avec le séquençage unicellulaire sont discutés ici. Avec des exemples de profils FACS indiquant une dissociation réussie et inefficace et des rendements de cellules stromales en aval dans l’analyse post-séquençage, des indications reconnaissables pour les utilisateurs sont fournies. La prise en compte des exigences spécifiques des cellules stromales est cruciale pour obtenir des résultats de haute qualité et reproductibles qui peuvent faire progresser les connaissances dans le domaine.

Introduction

Chez l’adulte en bonne santé, la production de novo de cellules sanguines se produit dans la moelle osseuse et le thymus. Les cellules stromales à ces sites sont essentielles au maintien de l’hématopoïèse, mais le stroma constitue moins de 1% du tissu 1,2,3,4. L’obtention d’isolats purs d’hématopoïèse soutenant le stroma constitue donc un défi important, en particulier pour la multiomique unicellulaire qui nécessite un traitement rapide pour obtenir des échantillons de haute qualité. Les composants de différents cocktails de digestion peuven....

Protocole

Tous les travaux sur des tissus humains ont été effectués après l’approbation du comité d’examen interne (IRB) du Massachusetts General Hospital. Toutes les procédures sur les animaux ont été menées conformément aux directives du Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Des souris C57Bl/6, âgées de 8 à 10 semaines, mâles et femelles, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux proviennent d’une source commerciale (voir la Table des matières).

1. Préparation du tissu thymique murin

1. Préparez les tampons et les solutions suivants.
   1. Medium 199....

Discussion

Les cellules stromales dans les organes hématopoïétiques sont essentielles à la production normale de sang et les perturbations du stroma hématopoïétique peuvent entraîner de graves altérations de l’entretien hématopoïétique et de la réponse au stress ^9,23,24. La connaissance des cellules stromales hématopoïétiques est essentielle pour comprendre les maladies hématologiques .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)	BD Biosciences	559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC	BD Biosciences	643510
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9647
C57Bl/6 mice	Jackson	664	Males or females, 8-12 weeks old
Calcein	Fisher Scientific	65-0853-78
Collagenase IV	Millipore Sigma	C5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm	Fisher Scientific	08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Biolegend	422801
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Dnase I Solution	Thermo Fisher Scientific	90083	2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit	StemCell Technologies	19860
Fetal Bovine Serum	Gibco	A31605-01	Qualified One Shot
Human Fc Block	BD Biosciences	564220
Liberase TM	Millipore Sigma	5401127001	Research Grade
Medium 199	Gibco	12350
Mouse anti-human CD235a-BV77	BD Biosciences	740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594	Biolegend	303130
Mouse anti-human CD45-BV77	Biolegend	304050
Mouse anti-human CD4-BV605	BD Biosciences	562658
Mouse anti-human CD66b-FITC	BD Biosciences	555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7	BD Biosciences	557760
Mouse anti-human EpCam-BV421	Biolegend	324220
Protector RNase Inhibitor	Millipore Sigma	3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594	Biolegend	120424
Rat anti-mouse CD11b-Biotin	Biolegend	101204
Rat anti-mouse CD140a-APC	Fisher Scientific	17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737	BD Biosciences	612802
Rat anti-mouse CD31-BV421	Biolegend	102424
Rat anti-mouse CD3-Biotin	Biolegend	100244
Rat anti-mouse CD45.2-Biotin	Biolegend	109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin	Biolegend	103204
Rat anti-mouse CD51-PE	Biolegend	104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711	BD Biosciences	563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700	Biolegend	108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin	Biolegend	108404
Rat anti-mouse Ter119-Biotin	Biolegend	116204
Rat anti-mouse Ter119-PE	Biolegend	116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7	Biolegend	116222
Stemxyme	Worthington Biochemical	LS004107