Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant

Résumé

L’article décrit l’optimisation des paramètres d’acquisition de la microscopie à fluorescence pour visualiser le transport axonal de cargaisons endogènes marquées à une résolution de neurone unique chez un nématode vivant.

Résumé

Le transport axonal est une condition préalable à la livraison des protéines axonales depuis leur site de synthèse dans le corps cellulaire neuronal jusqu’à leur destination dans l’axone. Par conséquent, la perte du transport axonal altère la croissance et la fonction neuronales. L’étude du transport axonal permet donc d’améliorer notre compréhension de la biologie des cellules neuronales. Avec les récentes améliorations de l’édition du génome CRISPR Cas9, le marquage endogène des cargaisons axonales est devenu accessible, permettant d’aller au-delà de la visualisation du transport basée sur l’expression ectopique. Cependant, le marquage endogène se fait souvent au détriment d’une faible intensité de signal et nécessite des stratégies d’optimisation pour obtenir des données robustes. Ici, nous décrivons un protocole pour optimiser la visualisation du transport axonal en discutant des paramètres d’acquisition et une approche de blanchiment pour améliorer le signal de la cargaison endogène marquée sur un fond cytoplasmique diffus. Nous appliquons notre protocole pour optimiser la visualisation des précurseurs de vésicules synaptiques (SVP) marqués par RAB-3 marqué par protéine fluorescente verte (GFP) afin de mettre en évidence comment l’ajustement fin des paramètres d’acquisition peut améliorer l’analyse de la cargaison axonale marquée de manière endogène chez Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

Tout au long de la vie, les neurones dépendent du transport axonal pour transporter les protéines, les lipides et d’autres molécules du corps cellulaire à leur destination finale dans l’axone. Par conséquent, l’altération du transport axonal est associée à une perte de la fonction neuronale et est souvent impliquée dans la pathologie des troubles neurodégénératifs ^1,2. Par conséquent, la compréhension des mécanismes sous-jacents au transport axonal est d’un grand intérêt.

Plusieurs décennies de recherche sur le transport axonal ont révélé de nombreu....

Protocole

Pour un protocole détaillé sur la façon de maintenir et de préparer les nématodes pour l’imagerie de cellules vivantes, reportez-vous aux travaux de S.Niwa ⁷.

1. Génération de souches de vers

En plus de générer des souches de nématodes, le Caenorhabditis Genetics Center (CGC)⁸ contient une collection croissante de souches de nématodes avec des protéines endogènes marquées par fluorescence qui peuvent être obtenues directement à partir de leur page Web.

1. Choix de la stratégie de marquage par fluorescence
   ....

Discussion

Limites de la méthode et méthodes alternatives
Dans ce protocole, nous avons optimisé les paramètres d’acquisition pour visualiser le transport axonal de RAB-3 marqué endogènement, qui est associé à des précurseurs de vésicules synaptiques. Pour visualiser RAB-3, nous avons utilisé une souche⁶ de FLIP-on ::GFP ::RAB-3 récemment publiée et exprimé la recombinase Flippase sous un promoteur spécifique de la cellule (glr-4p)

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)