Interférence de l’ARN chez le parasitoïde de l’œuf, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Résumé

La manipulation de l’interférence ARN (ARNi) présente un défi formidable chez de nombreuses espèces de parasitoïdes de petite taille, telles que les guêpes Trichogramma . Cette étude a permis de définir une méthode ARNi efficace chez Trichogramma denrolimi. La présente méthodologie fournit un modèle robuste pour étudier la régulation des gènes chez les guêpes Trichogramma .

Résumé

Les parasitoïdes des œufs, Trichogramma spp, sont reconnus comme des agents de lutte biologique efficaces contre divers lépidoptères nuisibles dans l’agriculture et les forêts. Les stades immatures de la progéniture de Trichogramma se développent dans l’œuf hôte, présentant une diminution remarquable (environ 0,5 mm de longueur adulte). La méthodologie d’interférence ARN (ARNi) est devenue un outil crucial pour élucider les fonctions des gènes dans de nombreux organismes. Cependant, la manipulation de l’ARNi chez certaines petites espèces de parasitoïdes, comme Trichogramma, a généralement posé des défis importants. Dans cette étude, nous présentons une méthode ARNi efficace chez Trichogramma denrolimi. La procédure décrite comprend l’acquisition et l’isolement de spécimens individuels de T. dendrolimi à partir d’œufs hôtes, la conception et la synthèse d’ARN double brin (ARNdb), la transplantation et la culture in vitro de pupes de T. dendrolimi , la micro-injection d’ARNdb et l’évaluation ultérieure de l’inactivation du gène cible par analyse RT-qPCR. Cette étude fournit une procédure complète et visuellement détaillée pour mener des expériences sur l’ARNi chez T. dendrolimi, permettant ainsi aux chercheurs d’étudier la régulation des gènes chez cette espèce. De plus, cette méthodologie est adaptable pour les études d’ARNi ou les micro-injections chez d’autres espèces de Trichogramma avec des ajustements mineurs, ce qui en fait une référence précieuse pour mener des expériences d’ARNi chez d’autres espèces endoparasitaires.

Introduction

Trichogramma spp. est un groupe de parasitoïdes d’œufs qui ont été largement utilisés comme agents de lutte biologique très efficaces contre un large éventail de lépidoptères nuisibles dans les écosystèmes agricoles et forestiers du monde entier 1,2,3,4. L’application de Trichogramma élevé en masse offre une approche respectueuse de l’environnement pour la gestion durable des ravageurs ^5,6,7. La compréhension de la biologie molécul....

Protocole

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments, logiciels et réactifs utilisés dans ce protocole.

1. Collecte et entretien de l’insecticulture

1. Coller un groupe de ~5 000 œufs de Corcyra cephalonica (Stainton) sur une carte de 9 cm sur 16 cm en utilisant une solution 1:5 (v/v) de gomme arabique en poudre et d’eau^25,26.
   REMARQUE : Évitez d’attacher trop d’œufs hôtes à la carte, car le surpeuplement rend peu pratique les procédures de transfert et de dissection ultérieures.
....

Résultats

Le taux d’émergence des pupes de T. denrolimi injectées avec dsFerhch était significativement inférieur à celui de celles injectées avec dsGFP ou de celles sans injection (tableau 1). Parmi les guêpes émergées, 51,85 % des guêpes T. denrolimi soumises au dsFerhch ont développé de petites ailes déformées. Les guêpes déformées n’ont pas été observées chez les guêpes injectées avec dsGFP ou sans aucune injection (tableau.......

Discussion

Les guêpes Trichogramma sont reconnues comme des agents de lutte biologique efficaces, ciblant spécifiquement une gamme de lépidoptères nuisibles dans l’agriculture et la foresterie¹. Ces guêpes minuscules subissent leurs stades immatures dans l’œuf hôte, une caractéristique qui présente des défis dans la réalisation d’expériences ARNi ^5,18. Cette étude offre un guide visuel complet pour la réalisation d’exp?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911