Adaptation aux extrêmes de la vie : évolution expérimentale avec l’archéon extrêmophile Sulfolobus acidocaldarius

Résumé

Ici, nous présentons un protocole d’évolution expérimental pour l’adaptation chez les thermophiles en utilisant des thermomélangeurs de paillasse peu coûteux et économes en énergie comme incubateurs. La technique est démontrée par la caractérisation de l’adaptation à la température chez Sulfolobus acidocaldarius, un archéon avec une température de croissance optimale de 75 °C.

Résumé

L’archéon Sulfolobus acidocaldarius est apparu comme un système modèle thermophile prometteur. L’étude de la façon dont les thermophiles s’adaptent aux changements de température est une exigence clé, non seulement pour comprendre les processus évolutifs fondamentaux, mais aussi pour développer S. acidocaldarius en tant que châssis pour la bio-ingénierie. L’un des principaux obstacles à la réalisation d’une évolution expérimentale avec des thermophiles est le coût de l’entretien de l’équipement et la consommation d’énergie des incubateurs traditionnels pour la croissance à haute température. Pour relever ce défi, un protocole expérimental complet pour mener à bien l’évolution expérimentale de S. acidocaldarius est présenté, en utilisant des thermomélangeurs de paillasse peu coûteux et économes en énergie. Le protocole implique une technique de culture par lots avec des volumes relativement faibles (1,5 ml), permettant le suivi de l’adaptation dans plusieurs lignées indépendantes. Cette méthode est facilement évolutive grâce à l’utilisation de thermomélangeurs supplémentaires. Une telle approche augmente l’accessibilité de S. acidocaldarius en tant que système modèle en réduisant à la fois l’investissement initial et les coûts permanents associés aux investigations expérimentales. De plus, la technique est transférable à d’autres systèmes microbiens pour explorer l’adaptation à diverses conditions environnementales.

Introduction

Les premières conditions de vie sur Terre peuvent provenir d’environnements extrêmes, tels que les cheminées hydrothermales, qui se caractérisent par des températures et une acidité extrêmement élevées¹. Les microbes continuent d’habiter des environnements extrêmes, notamment les sources chaudes et les solfatares volcaniques. La caractérisation de la dynamique évolutive qui se produit dans ces conditions extrêmes peut mettre en lumière les processus physiologiques spécialisés qui permettent la survie dans ces conditions. Cela peut avoir des implications très diverses, allant de notre compréhension des origines de la diversité biologique au développement de nouvelles enzymes à haute température ayant des applications biotechnologiques.

La compréhension de la dynamique évolutive microbienne dans des environnements extrêmes reste limitée malgré son importance cruciale. En revanche, un ensemble important de connaissances sur l’évolution dans les environnements mésophiles a été acquis grâce à l’application d’une technique connue sous le nom d’évolution expérimentale. L’évolution expérimentale consiste à observer le changement évolutif dans des conditions de laboratoire 2,3,4,5. Souvent, il s’agit d’un environnement de changement défini (p. ex., température, salinité, introduction d’une toxine ou d’un organisme concurrent)^7,8,9. Lorsqu’elle est combinée au séquençage du génome entier, l’évolution expérimentale nous a permis de tester des aspects clés des processus évolutifs, notamment le parallélisme, la répétabilité et la base génomique de l’adaptation. Cependant, à ce jour, la majeure partie de l’évolution expérimentale a été réalisée avec des microbes mésophiles (y compris les bactéries, les champignons et les virus^{2, 3, 4, 5}, mais en grande partie à l’exclusion des archées). Une méthode d’évolution expérimentale applicable aux microbes thermophiles nous permettrait de mieux comprendre comment ils évoluent et contribuerait à une compréhension plus complète de l’évolution. Cela a des implications potentiellement vastes, allant du déchiffrage des origines de la vie thermophile sur Terre aux applications biotechnologiques impliquant des « extrémozymes » utilisés dans les bioprocédés à haute température¹⁰ et la recherche astrobiologique¹¹.

L’archéon Sulfolobus acidocaldarius est un candidat idéal comme organisme modèle pour développer des techniques expérimentales d’évolution chez les thermophiles. S. acidocaldarius se reproduit en aérobie, avec une température de croissance optimale à 75 °C (plage de 55 °C à 85 °C) et une acidité élevée (pH 2-3)4,6,12,13,14. Remarquablement, malgré ses conditions de croissance extrêmes, S. acidocaldarius maintient des densités de population et des taux de mutation comparables à ceux des mésophiles 7,15,16,17,18. De plus, il possède un génome relativement petit et bien annoté (souche DSM639 : 2,2 Mb, 36,7 % GC, 2 347 gènes)¹² ; S. acidocaldarius bénéficie également d’outils robustes d’ingénierie génomique, permettant une évaluation directe du processus évolutif par le biais d’inactivation ciblée de gènes¹⁹. Un exemple notable de cela est la disponibilité de souches génétiquement modifiées de S. acidocaldarius, telles que les souches auxotrophes d’uracile de MW001¹⁹ et SK-1²⁰, qui peuvent servir de marqueurs sélectionnables.

La conduite d’une évolution expérimentale avec des thermophiles comme S. acidocaldarius présente des défis importants. L’incubation prolongée à haute température requise pour ces études impose une évaporation considérable pour les techniques de culture liquide et solide. Un fonctionnement prolongé à des températures élevées peut également endommager les incubateurs à agitation traditionnels qui sont couramment utilisés dans l’évolution expérimentale des milieux liquides. L’exploration de plusieurs températures nécessite un investissement financier substantiel pour l’acquisition et l’entretien de plusieurs incubateurs. De plus, la forte consommation d’énergie nécessaire soulève d’importantes préoccupations environnementales et financières.

Ce travail présente une méthode pour relever les défis rencontrés lors de la réalisation d’une évolution expérimentale avec des thermophiles comme S. acidocaldarius. S’appuyant sur une technique mise au point par Baes et al. pour étudier la réponse aux chocs thermiques^14,21, la méthode développée ici utilise des thermomélangeurs de paillasse pour une incubation à haute température constante et fiable. Son évolutivité permet l’évaluation simultanée de plusieurs traitements thermiques, avec des coûts réduits d’acquisition d’équipements d’incubation supplémentaires. Cela améliore l’efficacité expérimentale, permettant une analyse statistique robuste et une étude approfondie des facteurs influençant la dynamique évolutive chez les thermophiles²². De plus, cette approche réduit considérablement l’investissement financier initial et la consommation d’énergie par rapport aux incubateurs traditionnels, offrant ainsi une alternative plus durable et respectueuse de l’environnement.

Notre méthode jette les bases de l’étude expérimentale de la dynamique évolutive dans des environnements caractérisés par des températures extrêmes, qui peuvent avoir joué un rôle clé au cours des premières étapes de la diversification de la vie sur Terre. Les organismes thermophiles ont des propriétés uniques, mais leurs conditions de croissance extrêmes et leurs exigences spécifiques ont souvent limité leur accessibilité en tant que système modèle. Surmonter ces obstacles élargit non seulement les possibilités de recherche pour étudier la dynamique évolutive, mais renforce également l’utilité plus large des thermophiles en tant que systèmes modèles dans la recherche scientifique.

Protocole

1. Préparation du milieu de croissance de S. acidocaldarius (BBM⁺)

REMARQUE : Pour cultiver S. acidocaldarius, ce protocole utilise le milieu Basal Brock (BBM⁺)²³. Celui-ci est préparé en combinant d’abord les solutions mères inorganiques décrites ci-dessous pour créer BBM⁻, qui peut être préparé à l’avance. BBM⁺ est ensuite préparé au besoin en ajoutant les solutions mères organiques à BBM⁻. Des recettes de solutions mères sont également présentées dans le tableau 1. Tous les milieux et solutions mères doivent être préparés dans du H₂O (jjH₂O) doublement distillé.

1. Préparation de solutions mères inorganiques pour milieu de croissance
   1. Préparez la solution mère d’oligo-éléments.
      1. Préparez la solution mère d’oligo-éléments en ajoutant 9 g/L de tétraborate de sodium décahydraté (Na₂B₄O₇·10H₂O) à du ddH₂O, puis en ajoutant 1:1 H₂SO₄ goutte à goutte jusqu’à ce qu’il soit dissous.
      2. Introduire séquentiellement 0,44 g/L de sulfate de zinc heptahydraté (ZnSO₄·7H₂O), 0,1 g/L de chlorure de cuivre(II) dihydraté (CuCl₂·2H₂O), 0,06 g/L de molybdate de sodium dihydraté (Na₂MoO₄·2H₂O), 0,06 g/L de sulfate de vanadium(IV) dihydraté (VOSO 4.2H₂O), 0,02 g/L de sulfate de cobalt(II) heptahydraté (CoSO₄·7H₂O), et 3,6 g/L de chlorure de manganèse(II) tétrahydraté (MnCl₂·4H₂O). Autoclavez la solution et conservez-la à 4 °C.
   2. Préparez la solution mère de Fe (1000x) en dissolvant 20 g/L de chlorure ferrique hexahydraté (FeCl₃·6H₂O) dans du jdH₂O. Stérilisez la solution en la filtrant à travers un filtre de 0,22 μm et conservez-la à 4 °C.
   3. Préparez la solution Brock I (1000x) en dissolvant 70 g/L de chlorure de calcium (CaCl₂·2H₂O) dans de l’eau doublement distillée (ddH₂O). Autoclave et conservation à 4 °C.
      ATTENTION : La dissolution de CaCl₂·2H₂O dans l’eau est un processus exothermique. Effectuez cette étape avec précaution. Portez des gants antithermiques classés EN407 pour vous protéger contre les blessures. Ne fermez pas hermétiquement le récipient, car la pression pourrait s’accumuler.
   4. Préparez la solution Brock II/III en combinant 130 g/L de sulfate d’ammonium ((NH₄)₂SO₄), 25 g/L de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO₄·7H₂O), 28 g/L de dihydrogénophosphate de potassium (KH₂PO₄) et 50 mL de la solution mère d’oligo-éléments préalablement préparée. À l’aide de 1:1 H₂SO₄, ajustez le pH de la solution mère à 2-3. Autoclavez la solution et conservez-la à température ambiante (RT).
2. Préparation de solutions mères organiques pour milieu de croissance
   1. Préparez la solution mère de D-glucose (100x) en dissolvant 300 g/L (30% p/v) de D-glucose dans du_jdH2O et filtrez la stérilisation (à travers un filtre de 0,22 μm). Conserver à 4 °C.
      REMARQUE : D’autres sources de carbone peuvent être utilisées à la place du D-glucose selon les exigences expérimentales (par exemple, le D-xylose).
   2. Préparez le pepton à partir de la solution mère de caséine (100x) en dissolvant le peptone de la caséine à 100 g/L dans du ddH₂O. Autoclave pour stériliser et conserver la solution mère à RT.
   3. Préparer la solution mère d’uracile (100x) en dissolvant 2 g/L d’uracile dans du ddH₂O et stériliser par filtre (à travers un filtre de 0,22 μm) ; conserver à −20 °C.
3. Préparation du milieu de croissance BBM⁺ à une concentration de travail de 1x
   1. Tout d’abord, préparer 988 mL de ddH₂O stérile par autoclavage.
   2. Préparez 1 L de BBM⁻ en ajoutant 1 mL de solution mère I de Brock, 10 mL de solution mère II/III de Brock et 1 mL de solution mère de Fe aux 988 mL de ddH₂O stérile préalablement autoclave. Ajustez le pH du milieu à la plage de 2-3 avec 1:1 H₂SO₄.
      REMARQUE : BBM⁻ peut être préparé à l’avance et stocké chez RT jusqu’à 1 mois.
   3. Enfin, pour produire 1 L de BBM⁺, combinez 10 ml de D-Glucose Stock Solution, 10 ml de Peptone de Caséine Stock Solution et 10 ml de BBM− avec 985 ml de BBM⁻. Mélangez bien et ajustez le pH moyen à 2-3 avec 1:1 H₂SO₄.
      REMARQUE : BBM⁺ doit être fraîchement préparé au besoin.
4. Préparation du milieu solide BBM⁺
   1. Préparer des solutions mères 1 M de MgCl₂ et de CaCl₂ ; ceux-ci aideront à la solidification du milieu solide BBM. Pour 1 M MgCl₂, ajouter 9,5 g à 100 mL de ddH₂O. Pour 1 M de CaCl₂, ajouter 11 g à 100 mL de ddH₂O. Autoclave à stériliser.
      ATTENTION : La dissolution de CaCl₂·2H₂O dans l’eau est un processus exothermique. Effectuez cette étape avec précaution. Portez des gants antithermiques classés EN407 pour vous protéger contre les blessures. Ne fermez pas hermétiquement le récipient, car la pression pourrait s’accumuler.
   2. Mélanger 3 % (p/v) de gomme gellane (p. ex., 30 g/L) dans du jdH₂O et de l’autoclave pour stériliser.
      REMARQUE : La gomme gellane (par exemple, la gelrite) est utilisée ici comme agent gélifiant, car la gélose bactériologique standard ne peut pas se solidifier à 75 °C.
   3. Séparément, préparez BBM⁺ pour milieu solide, qui doit être mélangé dans un rapport de 1:1 avec la gomme gellane stérile préparée à l’étape 1.4.1.
      1. Tout d’abord, préparez 1 L de BBM⁻ comme à l’étape 1.3.2. Combinez 887 mL de BBM⁻ avec 1 mL de solution mère de Fe et 20 mL de solution mère de D-glucose, de peptone de la solution mère de caséine et de solution mère d’uracile.
      2. Ajouter 40 mL de 1 M MgCl₂ et 12 mL de 1 M CaCl₂. Mélangez bien et ajustez le pH moyen à 2-3 avec 1:1 H₂SO₄.
         REMARQUE : Les volumes de solutions mères ajoutés ici sont intentionnellement supérieurs à ceux de la préparation du BBM⁺ liquide à l’étape 1.3. Il s’agit de tenir compte du mélange dans un rapport de 1:1 avec de la gomme gellane fondue à l’étape suivante.
   4. Préchauffez le BBM⁺ pour milieu solide à environ 75 °C et mélangez dans un rapport de 1:1 avec de la gomme gellane fondue dans du ddH₂O. Mélangez bien et versez dans du plastique thermostable (par exemple, du polypropylène), des boîtes de Pétri en verre ou des plaques à six puits pour la croissance deS. acidocaldarius. Utilisez l’agar immédiatement une fois mélangé, car il prendra rapidement.
      REMARQUE : Certaines boîtes de Pétri en polystyrène de 90 mm couramment utilisées pour la microbiologie se déformeront si elles sont incubées à des températures élevées pendant de longues périodes.
      ATTENTION : Prenez les précautions de sécurité appropriées lorsque vous manipulez des liquides chauds ; porter des gants antithermiques classés EN407 pour se protéger contre les blessures.

2. Revitaliser S. acidocaldarius à partir d’une culture mère congelée

1. Préparation de tubes de croissance ventilés pour assurer une aération suffisante et une disponibilité en oxygène.
   1. À l’avance, préparez des tubes de microcentrifugation percés de 2 ml pour la croissance de Sulfolobus . Chauffez soigneusement un fil émoussé (>0,7 mm, comme un trombone redressé) à l’aide d’une flamme de bec Bunsen et percez le couvercle du tube en créant un petit trou d’environ 1 mm.
   2. Placez les tubes percés dans un récipient autoclavable (p. ex., boîte d’embout de pipette vide) et autoclave pour stériliser.
      ATTENTION : Portez des gants anti-thermiques classés EN407 pour vous protéger contre les blessures thermiques aux mains dues au métal chauffé. Ne chauffez le fil que pendant une courte période (1-2 s) pour éviter la surchauffe. Seuls les métaux à haute température de fusion (acier) doivent être utilisés.
2. Inoculer des cultures de démarrage de S. acidocaldarius.
   1. Remplissez les tubes de 2 mL percés en autoclave avec 1,5 mL de BBM⁺ préchauffé (tel que préparé à la section 1, pré-incubé à 75 °C pendant au moins 15 min).
   2. Inoculer les tubes remplis de BBM⁺ avec un grattage (équivalent à 50 à 60 mg) d’un stock de glycérol (25 % v/v de glycérol, stocké à -80 °C). Ici, la souche DSM639 de S. acidocaldarius est utilisée. Remplissez un tube supplémentaire avec 1,5 mL de BBM+ comme témoin négatif.
3. Pour éviter que des aérosols ne s’échappent du couvercle du tube percé de 2 mL et ne contaminent l’environnement de croissance (et tout autre échantillon) et pour réduire la variabilité de l’évaporation de la culture à l’intérieur des tubes, placez sur le couvercle une membrane perméable aux gaz qui peut résister à des températures élevées (65-85 °C) et bloquer l’échappement et l’infiltration microbiens.
   REMARQUE : L’utilisation de membranes perméables aux gaz pour sceller les tubes réduit considérablement l’évaporation. Au cours d’une période de 48 h à 75 °C, les tubes scellés présentent une perte de volume moyenne de 8,63 % (plage : 3,29-16,45 %, n = 24 répétitions techniques, répétées deux fois), contre 25,05 % (plage : 11,92-62,91 %, n = 24 répétitions techniques, répétées deux fois) pour les tubes non scellés.
4. Incuber les tubes inoculés dans un thermomélangeur à 75 °C avec agitation constante à 400 tours par minute (RPM) pendant 48 à 72 h ou jusqu’à ce que la DO_{600 nm} de 0,3 à 0,8 soit atteinte, mesurée par spectrophotomètre.
   REMARQUE : Le couvercle percé des tubes de 2 mL et l’agitation permettent une aération appropriée pour une croissance optimale. Le couvercle du thermomélangeur doit être en place pour assurer le maintien d’une température constante et pour réduire l’évaporation.
5. Après la période d’incubation, donnez aux cultures ravivées une deuxième phase de croissance (préconditionnement).
   1. Granulez les cultures en faisant tourner les tubes à 5000 x g pendant 2 min à RT. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 1,5 mL de BBM⁺ chaud frais.
      REMARQUE : Cette expérience utilise la souche sauvage DSM639 de S. acidocaldarius , mais ces méthodes de croissance et d’évolution expérimentale peuvent être appliquées à n’importe quelle souche de Sulfolobus et potentiellement à d’autres thermophiles.

3. Détermination de la densité de population, du temps de doublement et de la phase de croissance exponentielle de S. acidocaldarius

1. Déterminez la densité de la population et le temps jusqu’à la phase de croissance exponentielle pour les conditions de sélection choisies. Pour chaque condition environnementale à tester, préparer trois cultures de démarrage en suivant les étapes 2.1 à 2.5.
2. Diluez les trois cultures dans BBM⁺ à une DO_{de 600 nm} de 0,01. Préparez au moins 20 ml de chaque culture. Ces trois cultures représentent des répliques techniques.
3. Effectuez des courbes de croissance répliquées de_{600 nm} OD au fil du temps à l’aide d’un échantillonnage destructif.
   1. Préparez 24 tubes percés de 2 mL à l’étape 2.1, séparez-les en trois séries de huit et étiquetez ces répliques techniques 1, 2 et 3 (p. ex., huit tubes étiquetés comme réplique 1, etc.).
   2. À partir de chacune des trois cultures diluées de l’étape 3.2, pipeter 1,5 mL dans sept tubes préparés. Remplissez le tube restant avec 1,5 mL de BBM+ comme témoin négatif.
4. Incuber les 24 tubes dans un thermomélangeur à 75 °C et 400 tr/min. Sceller avec une membrane perméable aux gaz. À intervalles réguliers (par exemple 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 h), prélever un tube de chacune des trois répétitions et mesurer la DO_{de 600 nm} à l’aide d’un spectrophotomètre, puis jeter le tube. Remplacez la membrane perméable aux gaz après avoir retiré un tube.
5. En parallèle, déterminer la relation entre la DO_{600 nm} et la densité de population. Effectuez des dilutions en série (1 x ^10-1 à 1 x ^10-6) dans le milieu BBM⁺ pendant au moins trois points temporels (idéalement, début, milieu et fin). Inoculer 100 μL de chaque dilution sur un milieu solide BBM⁺ (préparé comme à l’étape 1.4).
   REMARQUE : Pour obtenir une croissance constante des colonies et des comptages précis, il est préférable de pipeter la culture diluée sur un milieu solide à un endroit sans effectuer d’étalement mécanique, par exemple à l’aide d’un épandeur en forme de L ou de billes de verre. L’étalement mécanique semble avoir un impact négatif sur la formation des colonies.
6. Incuber les plaques dans un incubateur statique à 75 °C jusqu’à l’apparition des colonies (5 à 7 jours).
   1. Pendant cette période, gardez l’incubateur humide pour éviter un dessèchement excessif des plaques, sinon les colonies ne se formeront pas.
   2. Pour ce faire, placez les plaques dans une boîte fermée en polypropylène doublée d’un chiffon humide. Percez le couvercle de la boîte au moins trois fois pour permettre l’aération.
   3. Placez des seaux d’eau dans l’incubateur pour augmenter l’humidité. Remplissez les seaux tous les jours.
7. Une fois que toutes les mesures de DO_{600 nm} ont été collectées, déterminez le temps de doublement et le temps pour atteindre la phase de croissance exponentielle en ajustant une courbe logistique à la relation entre DO_{600 nm} et le temps, par exemple, en utilisant SummarizeGrowth du package growthcurver dans R.
8. Une fois que les colonies visibles se sont formées sur un milieu solide, comptez les unités formant des colonies (UFC), en visant à compter à partir du facteur de dilution, produisant 50 à 100 colonies pour la meilleure précision.
9. Calculer la densité cellulaire dans le milieu de culture à l’aide de la formule : UFC/mL = nombre de colonies/(volume plaqué × facteur de dilution).
10. Effectuez une régression linéaire log-log pour déterminer la relation entre log10(CFU) et log10(OD_600nm). Ainsi, calculez la CFU/mL prédite pour une DO donnée à partir de la pente et de l’ordonnée à l’origine du modèle de régression : CFU prédit = 10^{[pente × log10(OD600nm) + ordonnée à l’origine].}
11. (Facultatif) Effectuez également les étapes 3.1 à 3.10 dans un incubateur à agitation pour déterminer si une croissance comparable est obtenue dans les thermomélangeurs.

4. Initiation de lignées indépendantes pour l’évolution expérimentale

1. Jour 1 : Pour générer des colonies uniques, effectuez d’abord toutes les étapes de la section 2 ci-dessus pour générer une culture de départ.
2. Jour 3 : Mesure de la DO_{600 nm} de la culture pour s’assurer qu’elle a atteint une densité suffisante dans la phase exponentielle (DO_{600 nm} 0,3-0,8 par spectrophotomètre).
3. Créer des dilutions en série de la culture DSM639 de S. acidocaldarius à partir de 1 x ^10-1-1 x ^10-6 et étaler 100 μL de chaque dilution 1 x ^10-5 et 1 x ^10-6 dans des puits d’une plaque à 6 puits contenant un milieu solide BBM⁺ (section 1 et tableau 1) en plusieurs répétitions. Incuber les plaques à 75 °C dans un incubateur statique comme à l’étape 3.5 pendant 5 à 7 jours pour que les colonies individuelles émergent.
4. Jours 8-10 (5-7 jours après l’incubation) :
   1. Établissez le nombre de lignées évolutives à partir de colonies uniques. Pour chaque lignée, choisissez une colonie au hasard dans les plaques à l’aide d’une boucle d’inoculation. Remettre la colonie en suspension dans un tube percé de 2 mL contenant 1,5 mL de milieu BBM⁺ préchauffé. Étiquetez correctement le tube.
   2. Répétez l’opération pour le nombre souhaité de lignées ; ici, sept lignées ont été établies et étiquetées SA1-7. Remplissez un tube supplémentaire avec 1,5 mL de BBM+ comme témoin négatif.
   3. Scellez le haut des tubes avec une membrane respirante et incubez dans un thermomélangeur à 75 °C, 400 tr/min pendant 48-72 h, jusqu’à ce que les cultures deviennent troubles (équivalent à_{OD 600nm} 0,3-0,8 par spectrophotomètre).
5. Jours 10 à 12 (7 à 9 jours après l’inoculation) :
   1. Dans une centrifugeuse de paillasse, faites tourner les cultures clonales à 5 000 x g pendant 1 min à RT. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille avec 200 μL de BBM⁺ liquide.
   2. Mélangez les suspensions cellulaires de 200 μL avec 200 μL de glycérol à 50 % (25 % de glycérol v/v) pour créer des stocks de glycérol des sept lignées indépendantes et stockez-les à -80 °C. Ce sont les populations ancestrales pour les expériences d’évolution.

5. Réalisation de l’expérience d’évolution de la température

REMARQUE : La figure 1 présente un schéma conceptuel décrivant les principaux aspects du protocole d’expérience.

1. Utilisez les sept populations ancestrales générées dans la section 4 pour l’expérience de l’évolution.
   1. Effectuer tous les essais expérimentaux d’évolution dans des tubes stériles, percés de 2 mL et scellés par une membrane perméable (décrits ci-dessus, section 2).
   2. Parallèlement à ces populations, maintenir des tubes percés séparés de 2 mL avec 1,5 mL de BBM⁺ comme témoins négatifs exempts de culture afin de surveiller la contamination (croisée) et de fixer un seuil de DO indiquant l’absence de croissance de la culture.
2. Etablir les traitements thermiques : L’utilisation de thermomélangeurs permet d’établir plusieurs traitements thermiques. Ici, utilisez les traitements de température suivants : constante 75 °C, constante 65 °C, et diminuant progressivement de 75 à 65 °C en diminuant la température de 1 °C tous les 4 jours (« traitement de chute de température »).
   REMARQUE : Ces traitements peuvent être adaptés à des exigences expérimentales spécifiques. Un thermomélangeur séparé est nécessaire pour chaque traitement thermique.
3. Jour 1 : Faire revivre les populations ancestrales à partir de leurs stocks de glycérol (préparé à l’étape 4.5) en suivant les étapes décrites dans la section 2.
4. Jour 3 :
   1. Diluez ces cultures à une DO_{de 600 nm} de 0,01 (mesurée par spectrophotomètre) à un volume total d’au moins 6 mL de BBM⁺ préchauffé. Aliquote 1,5 mL de chacune des sept cultures de populations ancestrales diluées dans trois tubes distincts percés de 2 mL, un pour chaque traitement thermique établi à l’étape 5.2.
      REMARQUE : Cette étape d’aliquottage permet de s’assurer que toute variation génétique présente dans chaque population ancestrale est présente dans tous les traitements thermiques au début de l’expérience d’évolution. Ces cultures agiront comme un transfert 0 (Tx0) pour commencer l’expérience d’évolution de la température.
   2. Scellez les tubes avec la membrane respirante et placez chaque ensemble de sept populations ancestrales dans des thermomélangeurs séparés. Réglez chaque thermomélangeur à la température requise et à 400 tr/min pour commencer l’expérience d’évolution.
5. Jour 5 :
   1. Après 48 h, effectuer le transfert 1 (Tx1) en inoculant 1,5 mL de milieu BBM⁺ réchauffé dans un tube percé de 2 mL avec 15 μL de culture de chacune des cultures Tx0 (dilution 1:100). Pour plus de rapidité, effectuez cette étape avec une pipette multicanaux à largeur variable pour effectuer plusieurs transferts à partir d’une seule expérience à l’unisson, réduisant ainsi le temps pendant lequel les cultures sont hors du thermomélangeur.
   2. Comme précédemment, scellez les tubes avant de les remettre dans des positions aléatoires dans leurs thermomélangeurs respectifs. Effectuez la randomisation manuellement ou via les randomiseurs à 96 puits iMetaLab.
6. Mesurez la DO_{de 600 nm} de Tx0 dans un spectrophotomètre à plaques (200 μL dans des plaques à 96 puits ; un même volume de BBM⁺ est utilisé comme blanc) pour suivre la croissance des lignées indépendantes.
   REMARQUE : Le diamètre extérieur_{de 600 nm} doit être mesuré après avoir effectué le transfert dans un milieu frais pour éviter toute contamination. La densité optique peut également être mesurée par d’autres moyens, par exemple avec un spectrophotomètre standard. L’utilisation d’un spectrophotomètre à plaques permet de mesurer simultanément plusieurs cultures, ce qui simplifie le processus.
7. Répétez les étapes 5.5 et 5.6 les jours 7, 9, 11, etc., correspondant à Tx2, Tx3, Tx4, etc. Maintenez la température constante pour les traitements à 75 °C et 65 °C. Pour le traitement de chute de température, diminuez la température de 1 °C tous les deux transferts (c’est-à-dire sur Tx2, Tx4, Tx6, etc.).
8. Préparez les stocks de glycérol (étape 3.2.3) des populations après chaque 10^e transfert (c’est-à-dire Tx10, Tx20, etc.), en étiquetant le tube avec l’identifiant de la population ancestrale (par exemple, SA1 pour la 1ère^{population indépendante)} et le numéro de transfert (par exemple, Tx10 pour le 10^ème transfert). Utiliser ces stocks de glycérol plus tard pour relancer les populations, pour étudier comment les populations ont changé au fil du temps ou pour redémarrer l’expérience au besoin (p. ex., en raison d’une contamination ou d’incidents inattendus entraînant la perte de cultures).
9. Que l’expérience se poursuive soit pour un nombre prédéterminé de transferts, soit jusqu’à ce qu’un nombre prédéterminé de générations se soit écoulé. Lors du transfert final, préparez les stocks de glycérol de toutes les lignées descendantes.
   REMARQUE : Ici, l’expérience s’est poursuivie jusqu’à ce que le traitement de chute de température atteigne 65 °C, ce qui s’est produit sur Tx22. Cela correspond à environ 150 générations (calculé sur la base du facteur de dilution de 100 en 4,6 : log₂(100) = 6,64 générations par transfert). La durée des expériences d’évolution peut être ajustée en fonction des exigences expérimentales.

6. Essais de croissance des expériences post-évolutionnistes : lignées ancestrales et lignées évoluées

REMARQUE : La figure 2 présente un schéma conceptuel décrivant le protocole d’essai de croissance et de valeur adaptative.

1. Préparez des tubes percés de 2 mL avec 1,5 mL de BBM⁺. Préparez suffisamment de tubes pour faire pousser toutes les lignées descendantes ainsi que chacune des souches ancestrales.
2. Faire revivre les populations ancestrales et chaque population descendante stockée à l’étape 5.9 après le transfert final de l’expérience d’évolution en utilisant la méthode décrite aux étapes 2.2 à 2.5, mais avec incubation à la température que chaque population a connue pour les deux derniers transferts de l’expérience d’évolution, c’est-à-dire 75 °C pour le traitement par constante de 75 °C et 65 °C pour les expériences de constante de 65 °C et de chute de température. Pour obtenir des densités de population comparables, effectuer l’incubation à 75 °C pendant 72 h et l’incubation à 65 °C pendant 120 h.
3. Mesurez la DO_{600 nm} des cultures cultivées à l’aide d’un spectrophotomètre à plaques.
4. Effectuer des essais de croissance de chaque population descendante et de chaque souche ancestrale aux deux températures (c.-à-d. 75 °C et 65 °C) en trois répétitions. Préparez des tubes à centrifuger percés de 2 mL avec 1,5 mL de BBM⁺. Préparez six tubes pour chaque lignée évoluée et chaque souche ancestrale. Étiquetez les tubes avec le nom de la lignée (SA1-7 ou ancêtre), la température de croissance (75 °C ou 65 °C) et l’ID de la répétition (1, 2 ou 3).
   REMARQUE : S’il y a moins de six thermomélangeurs disponibles, l’essai de croissance peut être répété sur plusieurs jours sur plusieurs blocs expérimentaux. Dans ce cas, il est important de mesurer chaque lignée et ancêtre dans chaque bloc expérimental afin que les effets de bloc puissent être estimés et pris en compte statistiquement.
5. Inoculer le milieu frais dans les six tubes préparés avec 15 μL de culture de chaque lignée descendante et souche ancestrale.
6. Réglez trois thermomélangeurs à 75 °C et trois thermomélangeurs à 65 °C, en désignant chaque thermomélangeur par une réplique ID. Placez les tubes dans le thermomélangeur correspondant à la température et à la réplique ID. À l’intérieur de chaque thermomélangeur, assurez-vous que les lignées et les ancêtres sont placés au hasard pour contrôler l’hétérogénéité.
7. Scellez chaque ensemble de 24 tubes avec une membrane perméable. Incubation pendant 48 h.
8. Transvaser 200 μL de chaque culture dans une plaque de 96 puits. Mesurez OD_600nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
   REMARQUE : Une pipette multicanaux à largeur variable peut être utilisée pour faciliter le transfert entre les tubes de microcentrifugation et les plaques à 96 puits.
9. Tracer et analyser des données à l’aide d’un logiciel statistique (p. ex., R).

7. Séquençage du génome entier des lignées évoluées et identification des mutations

1. Réactiver les lignées descendantes stockées à l’étape 5.9 dans BBM⁺ préchauffé à 75 °C de 48 à 72 h en insérant une raclée de glace de chaque population congelée dans BBM⁺ comme il est indiqué à la section 2, étapes 2.2 à 2.5. Préparez entre 1 et 10 ml de volume de culture pour obtenir une quantité suffisante d’ADN génomique. Le volume exact requis dépend de l’option choisie pour le séquençage aux étapes 7.2 ou 7.3 (ci-dessous).
   REMARQUE : Il est recommandé de séquencer également la souche utilisée pour initier les populations ancestrales. Il s’agit de déterminer correctement si les mutations détectées dans les lignées descendantes sont apparues pendant l’expérience d’évolution et non avant.
2. (Option 1) Extrayez l’ADN génomique et préparez des banques de séquençage Illumina pour le séquençage Illumina.
   1. Extrayez et purifiez l’ADN génomique à l’aide d’un kit commercial d’extraction d’ADN génomique pour les bactéries.
   2. Assurez-vous que l’ADN génomique extrait répond aux exigences de quantité et de qualité du fournisseur de séquençage en utilisant des kits commerciaux recommandés par le fournisseur.
   3. Effectuer la préparation d’une banque d’ADN génomique à l’aide d’un kit commercial selon le protocole du fabricant. Un protocole d’extrémité appariée de 250 pb est recommandé. Conservez l’ADN génomique extrait à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à soumettre les échantillons au fournisseur de séquençage.
3. (Option 2) Vous pouvez également envoyer les échantillons à un fournisseur commercial qui effectue l’extraction de l’ADN, les contrôles de la qualité de l’ADN génomique, la préparation de banques Illumina et le séquençage Illumina en tant que service combiné.
4. Analysez les génomes séquencés pour identifier les mutations.
   1. Recevez des fichiers FASTQ et, si ce n’est pas déjà fait par le fournisseur de séquençage, effectuez le découpage de l’adaptateur à l’aide de Trimmomatic avec une limite de qualité de fenêtre coulissante de Q15.
   2. À l’aide des fichiers FASTQ tronqués, exécutez le pipeline breseq (version 0.38.1) pour détecter les mutations, en comparant les lectures d’ADN génomique à la séquence de référence de la souche choisie. Pour S. acidocaldarius DSM639, il s’agit de RefSeq ID NC_007181.

8. (Facultatif) Évaluation de la consommation d’énergie du thermomélangeur par rapport à l’incubateur

1. Pour comparer la consommation d’énergie de l’utilisation d’un incubateur par rapport à celle d’un thermomélangeur pour la croissance, mesurez la consommation d’énergie de chaque appareil sur 24 h à l’aide d’une prise de surveillance d’énergie.
2. Utilisez deux prises pour mesurer la consommation d’énergie des deux appareils en même temps. Vous pouvez également mesurer la consommation d’énergie sur des jours successifs.
3. Débranchez l’incubateur ou le thermomélangeur de la prise électrique. Branchez la fiche de surveillance de l’énergie dans la prise et initialisez-la selon les instructions du fabricant, y compris l’installation du logiciel de surveillance et de contrôle.
4. Branchez l’incubateur ou le thermomélangeur dans la prise de surveillance de l’énergie et laissez-le fonctionner pendant au moins 2 h (mais idéalement pendant 24 h ou plus) pour obtenir une bonne estimation de la consommation d’énergie typique. Enregistrez la consommation d’énergie de chaque appareil.

Résultats

Mesures de la courbe de croissance
Les courbes de croissance de S. acidocaldarius DSM639 sont illustrées à la figure 3A. La croissance s’est avérée similaire lorsque l’on compare l’incubation à l’aide de thermomélangeurs avec celle des incubateurs conventionnels. Les paramètres du taux de croissance moyen ont été estimés en ajustant une courbe logistique à chaque courbe de croissance répliquée et en calculant...

Discussion

Ce travail a permis de développer un protocole d’évolution expérimental pour les thermophiles, ici adapté à l’archéon S. acidocaldarius, mais adaptable à d’autres microbes ayant des besoins de croissance à haute température. Ce protocole s’appuie sur des techniques initialement conçues pour les bactéries mésophiles, mais est spécifiquement modifié pour surmonter les défis techniques associés à la croissance aérobie à haute température

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe-driven membrane filters	StarLab	E4780-1226	For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loops	Greiner	731161, 731165, or 731101	For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tips	StarLab	S1111-6811	Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubes	StarLab	S1620-2700	For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tips	StarLab	S1111-0816	Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottom	Corning	430828 or 430829	Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using.
50 mL syringe	BD plastipak	300865	For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)	Nunc	260860	For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipette	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	For Brock stock solution I.
Autoclave	Priorclave	B60-SMART or SV100-BASE	Other autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)	Greiner	M9062	Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)	Supelco	1025560100	For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishes	Brand	BR455742	Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
Incubator	New Brunswick	Innnova 42R	Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Supelco	103943	For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	For Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring	Tapo	Tapo P110	To monitor energy consumtion
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)	none	none	For piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	For Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	For Trace element stock solution.
Spectrophotometer	BMG	SPECTROstar OMEGA	For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	For Trace element stock solution.