Adaptation aux extrêmes de la vie : évolution expérimentale avec l’archéon extrêmophile Sulfolobus acidocaldarius

Résumé

Ici, nous présentons un protocole d’évolution expérimental pour l’adaptation chez les thermophiles en utilisant des thermomélangeurs de paillasse peu coûteux et économes en énergie comme incubateurs. La technique est démontrée par la caractérisation de l’adaptation à la température chez Sulfolobus acidocaldarius, un archéon avec une température de croissance optimale de 75 °C.

Résumé

L’archéon Sulfolobus acidocaldarius est apparu comme un système modèle thermophile prometteur. L’étude de la façon dont les thermophiles s’adaptent aux changements de température est une exigence clé, non seulement pour comprendre les processus évolutifs fondamentaux, mais aussi pour développer S. acidocaldarius en tant que châssis pour la bio-ingénierie. L’un des principaux obstacles à la réalisation d’une évolution expérimentale avec des thermophiles est le coût de l’entretien de l’équipement et la consommation d’énergie des incubateurs traditionnels pour la croissance à haute température. Pour relever ce défi, un protocole expérimental complet pour mener à bien l’évolution expérimentale de S. acidocaldarius est présenté, en utilisant des thermomélangeurs de paillasse peu coûteux et économes en énergie. Le protocole implique une technique de culture par lots avec des volumes relativement faibles (1,5 ml), permettant le suivi de l’adaptation dans plusieurs lignées indépendantes. Cette méthode est facilement évolutive grâce à l’utilisation de thermomélangeurs supplémentaires. Une telle approche augmente l’accessibilité de S. acidocaldarius en tant que système modèle en réduisant à la fois l’investissement initial et les coûts permanents associés aux investigations expérimentales. De plus, la technique est transférable à d’autres systèmes microbiens pour explorer l’adaptation à diverses conditions environnementales.

Introduction

Les premières conditions de vie sur Terre peuvent provenir d’environnements extrêmes, tels que les cheminées hydrothermales, qui se caractérisent par des températures et une acidité extrêmement élevées¹. Les microbes continuent d’habiter des environnements extrêmes, notamment les sources chaudes et les solfatares volcaniques. La caractérisation de la dynamique évolutive qui se produit dans ces conditions extrêmes peut mettre en lumière les processus physiologiques spécialisés qui permettent la survie dans ces conditions. Cela peut avoir des implications très diverses, allant de notre compréhension des origines ....

Protocole

1. Préparation du milieu de croissance de S. acidocaldarius (BBM⁺)

REMARQUE : Pour cultiver S. acidocaldarius, ce protocole utilise le milieu Basal Brock (BBM⁺)²³. Celui-ci est préparé en combinant d’abord les solutions mères inorganiques décrites ci-dessous pour créer BBM⁻, qui peut être préparé à l’avance. BBM⁺ est ensuite préparé au besoin en ajoutant les solutions mères organiques à BBM⁻. Des recettes de solutions mères sont également présentées dans le tableau 1. Tous les mi....

Discussion

Ce travail a permis de développer un protocole d’évolution expérimental pour les thermophiles, ici adapté à l’archéon S. acidocaldarius, mais adaptable à d’autres microbes ayant des besoins de croissance à haute température. Ce protocole s’appuie sur des techniques initialement conçues pour les bactéries mésophiles, mais est spécifiquement modifié pour surmonter les défis techniques associés à la croissance aérobie à haute température

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe-driven membrane filters	StarLab	E4780-1226	For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loops	Greiner	731161, 731165, or 731101	For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tips	StarLab	S1111-6811	Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubes	StarLab	S1620-2700	For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tips	StarLab	S1111-0816	Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottom	Corning	430828 or 430829	Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using.
50 mL syringe	BD plastipak	300865	For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)	Nunc	260860	For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipette	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	For Brock stock solution I.
Autoclave	Priorclave	B60-SMART or SV100-BASE	Other autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)	Greiner	M9062	Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)	Supelco	1025560100	For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishes	Brand	BR455742	Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
Incubator	New Brunswick	Innnova 42R	Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Supelco	103943	For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	For Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring	Tapo	Tapo P110	To monitor energy consumtion
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)	none	none	For piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	For Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	For Trace element stock solution.
Spectrophotometer	BMG	SPECTROstar OMEGA	For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	For Trace element stock solution.