Culture en suspension, production et purification de virus adéno-associés par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol pour des applications in vivo

Résumé

Le virus adéno-associé est produit en culture cellulaire en suspension et purifié par centrifugation à double gradient de densité d’iodixanol. Des étapes sont incluses pour augmenter le rendement total du virus, réduire le risque de précipitation du virus et concentrer davantage le produit viral final. Les titres finaux attendus atteignent 10^{à 12} particules virales/mL et conviennent à une utilisation préclinique in vivo .

Résumé

Ce protocole décrit la production et la purification de virus adéno-associés recombinants (rAAV) par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, une méthode de purification de l’AAV indépendante du sérotype décrite pour la première fois en 1999. Les vecteurs rAAV sont largement utilisés dans les applications de thérapie génique pour délivrer des transgènes à divers types de cellules humaines. Dans ce travail, le virus recombinant est produit par transfection de cellules Expi293 en culture en suspension avec des plasmides codant pour les gènes auxiliaires du transgène, de la capside vectorielle et de l’adénoviral. La centrifugation par gradient de densité d’iodixanol purifie les particules AAV complètes en fonction de la densité des particules. De plus, trois étapes sont incluses dans cette méthodologie désormais omniprésente afin d’augmenter le rendement total du virus, de diminuer le risque de précipitation due aux protéines contaminantes et de concentrer davantage le produit viral final, respectivement : précipitation des particules virales à partir de milieux cellulaires à l’aide d’une solution de polyéthylène glycol (PEG) et de chlorure de sodium, introduction d’un deuxième cycle de centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, et échange de tampon via un filtre centrifuge. En utilisant cette méthode, il est possible d’obtenir des titres constants de l’ordre de 10^{à 12} particules virales/mL d’une pureté exceptionnelle pour une utilisation in vivo .

Introduction

Les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) sont des outils largement utilisés pour le traitement des maladies génétiques, notamment l’amyotrophie spinale, la dystrophie rétinienne et l’hémophilie A ^1,2,3. Les vecteurs rAAV sont conçus pour ne pas contenir de gènes viraux présents dans l’AAV⁴ de type sauvage, un petit virus icosaédrique sans enveloppe avec un génome linéaire monocaténaire de 4,7 kb. L’AAV a été découvert pour la première fois dans les années 1960 en tant que contaminant des préparations d’adénovirus⁵.....

Protocole

La composition des solutions et des tampons utilisés dans ce protocole est fournie dans le tableau 1.

Solution	Composition
Tampon de lyse AAV	1,2 mL de solution de NaCl 5 M
	2 mL de solution de 1 M de Tris-HCl pH 8,5
	80 μL de solution de 1 M de MgCl2
	mQ d’eau à 40 mL
Solution de précipitation AAV

Discussion

Le protocole de purification à double gradient de densité d’iodixanol est la méthode universelle car il est applicable à tous les variants mutants AAV, quelle que soit leur spécificité de récepteur. Les premières méthodes de purification des AAV reposaient sur la densité des particules et comprenaient la centrifugation isopycnique dans le CsCl et la centrifugation continue par gradient de densité du saccharose¹⁹. Plus tard, des approches spécifiques au sérotype ont été développé.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5810 R benchtop centrifuge	Eppendorf	22625501
8-channel peristaltic pump	Watson-Marlow	020.3708.00A
Automated cell counter	NanoEntek	EVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifuge	Beckman Coulter	369001
Benzonase	Thermo Scientific	88701
Biological safety cabinet	Labconco	322491101
CO2 incubator with shaker			Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339652	50 mL
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339650	15 mL
Disposable micro-pipets	Fisherbrand	21-164-2G	Capillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)	Sigma-Aldrich	D1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope	Nikon
Expi293 Expression Medium	Gibco	A1435101
Expi293F cells	Gibco	A14527
Filter tips	USA Scientific	1126-7810	1000 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-8810	200 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-1810	20 µL
Filter tips	USA Scientific	1121-3810	10 µL
Hypodermic needles	Tyco Healthcare	820112	20 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lid	VWR	10146-184
JS-5.3 rotor	Beckman Coulter	368690
Magnesium chloride solution (1 M)	Millipore Sigma	M1028-100ML
Metal stand and clamp	Fisherbrand	05-769-6Q
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	22600028	1.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Gibco	31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)	Serumwerk	AXS-1114542	60% iodixanol solution
P1000 Pipet	Gilson	F144059M
P2 Pipet	Gilson	F144054M
P20 Pipet	Gilson	F144056M
P200 Pipet	Gilson	F144058M
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4474
Pipet-Aid XP pipette controller	Drummond Scientific	4-000-101
Plasmid pCapsid	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pACGrh74.
Plasmid pHelper	Addgene	112867
Plasmid pTransgene	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)	Mp Biomedicals	92750049
Polyethylene glycol 8000	Research Products International	P48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)	Polysciences	NC1038561	Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	431123	500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	430776	250 mL
Polypropylene Optiseal tubes	Beckman Coulter	361625
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP250-B	50 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP225-B	25 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP210-B	10 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP205-B	5 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV1000	1 L
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV50-0	500 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV250	250 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV12-5	125 mL
Sodium chloride solution (5 M)	Fisher Scientific	NC1752640
Sterile syringes	Fisherbrand	14-955-458	5 mL
Syringe filter	Millipore	SLGV013SL	0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)	Kd Medical	RGE3363
Trypan blue solution	Gibco	15250061
Tube rack assembly	Beckman Coulter	361646
Tube spacers (x4)	Beckman Coulter	361669
Tubing for peristaltic pump	Fisher Scientific	14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor	Beckman Coulter	337922
Ultra low temperature freezer			Set at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentrator	Sartorius	VS2041
Water bath			Set at 37 °C