Hémostase de la plaie perforante et préparation d’échantillons pour l’analyse par microscopie électronique à large rayon

Résumé

Une procédure de plaie perforante pour la formation de thrombus hémostatiques est présentée ici. Les thrombus formés sont grands et ont des centaines de microns de diamètre. Par conséquent, les approches d’imagerie volumique sont appropriées. Nous suggérons la microscopie électronique à transmission à large zone comme approche à haute résolution accessible au plus grand nombre et détaillons un protocole préparatif.

Résumé

L’hémostase, le processus de contrôle physiologique normal des lésions vasculaires, est fondamentale pour la vie humaine. Nous souffrons tous de coupures mineures et de blessures par perforation de temps en temps. Dans l’hémostase, l’agrégation plaquettaire auto-limitante conduit à la formation d’un thrombus structuré dans lequel l’arrêt du saignement provient du recouvrement du trou par l’extérieur. Une caractérisation détaillée de cette structure pourrait conduire à des distinctions entre l’hémostase et la thrombose, un cas d’agrégation plaquettaire excessive conduisant à une coagulation occlusive. Une approche basée sur l’imagerie de la structure du thrombus de la plaie perforante est présentée ici qui s’appuie sur la capacité de la microscopie électronique à section mince à visualiser l’intérieur des thrombus hémostatiques. L’étape la plus fondamentale de tout protocole expérimental basé sur l’imagerie est une bonne préparation des échantillons. Le protocole fournit des procédures détaillées pour préparer les plaies par perforation et les thrombus riches en plaquettes chez la souris pour la microscopie électronique ultérieure. Une procédure détaillée est donnée pour la fixation in situ du thrombus de la plaie perforante en formation et son traitement ultérieur pour la coloration et l’enrobage pour la microscopie électronique. La microscopie électronique est présentée comme la technique d’imagerie finale en raison de sa capacité, lorsqu’elle est combinée à une coupe séquentielle, à visualiser les détails de l’intérieur du thrombus à haute résolution. En tant que méthode d’imagerie, la microscopie électronique permet d’obtenir un échantillonnage non biaisé et un résultat expérimental qui s’échelonne du nanomètre au millimètre en 2 ou 3 dimensions. Nous citons un logiciel gratuit de microscopie électronique approprié qui prendra en charge la microscopie électronique à grande échelle dans laquelle des centaines d’images peuvent être mélangées pour donner une imagerie à l’échelle nanométrique de sections efficaces entières de thrombus de plaie perforante. Par conséquent, n’importe quelle sous-région du fichier image peut être facilement placée dans le contexte de la section transversale complète.

Introduction

La formation d’un thrombus perforant qui conduit à l’arrêt de l’hémorragie est l’un des événements les plus essentiels de la vie¹. Pourtant, malgré cette essentialité, la connaissance de ce qui se passe structurellement lors de la formation d’un thrombus, que ce soit dans une veine, une artère, un événement athérosclérotique ou un caillot occlusif, a été limitée par la résolution et la profondeur de l’imagerie. La microscopie optique conventionnelle est limitée en profondeur par rapport à un thrombus de plaie perforante entièrement formé, de 200 à 300 μm en Z¹, et en niveau de résolution par rapport à la taille des organites plaquettaires et à leur espacement, souvent inférieur à 30 nm². La microscopie optique à deux photons peut fournir la profondeur d’imagerie nécessaire, mais n’améliore pas la résolution de manière significative. Les progrès les plus récents en microscopie optique, par exemple, les techniques de super-résolution, sont encore limités en résolution, en pratique ~20 nm en XY et deux fois plus en Z, et la profondeur limitée, pas plus que la microscopie optique conventionnelle. De plus, la microscopie optique à super-résolution, comme une grande partie de la microscopie optique de recherche, est basée sur la microscopie à fluorescence, une technique qui est intrinsèquement biaisée par rapport à un petit ensemble de protéines candidates pour lesquelles il existe de bons anticorps ou de bonnes constructions étiquetées³. En conclusion, la microscopie électronique à balayage conventionnelle peut, tout au plus, visualiser la surface du thrombus riche en plaquettes en formation.

Pour surmonter ces limitations techniques à la caractérisation de la structure du thrombus, nous avions trois objectifs. Tout d’abord, produire de manière reproductible une plaie perforante définie dans une veine ou une artère de souris qui pourrait ensuite être facilement stabilisée in situ par fixation chimique. Deuxièmement, appliquez une procédure préparative qui met l’accent sur la préservation de la membrane, un objectif compatible avec l’objectif de définir la position des plaquettes individuelles dans le thrombus en formation. Troisièmement, utilisez une technique de visualisation impartiale qui, en une seule image, pourrait être mise à l’échelle entre le nanomètre et le millimètre.

La microscopie électronique à large zone montée a été choisie comme technique majeure de visualisation finale pour une seule raison importante : en imagerie au microscope électronique, on voit un vaste éventail de caractéristiques à l’intérieur d’une cellule qui décrit ses organites et ses caractéristiques à l’intérieur des organites. De petits objets tels que les ribosomes peuvent être reconnus. Cette gamme de caractéristiques est observée parce que les colorants de métaux lourds denses en électrons, l’uranyle, le plomb et l’osmium, qui sont utilisés pour la microscopie électronique pour produire un contraste se lient à un large éventail de molécules. Dans une image au microscope électronique, on voit une grande partie de ce qui s’y trouve, tandis qu’avec les approches d’immunofluorescence et de marquage des protéines, on ne voit que ce qui s’allume. Il s’agit, par exemple, des sites antigéniques présents sur une espèce protéique individuelle donnée. Dans le cas d’une molécule marquée, souvent une protéine, il s’agit du ou des sites où se trouve cette protéine. Toutes les autres molécules sont sombres et non éclairées. Cependant, ce choix de la microscopie électronique est-il pratique ? Un thrombus perforant a une taille de 300 par 500 μm et, à une taille de pixel de 3 nm, cela représente une image de 100 000 par 167 000 pixels. Une caméra de microscope électronique de haute qualité a 4000 par 4000 pixels. Cela signifie qu’environ 1000 images doivent être assemblées/mélangées pour donner une seule image. C’est une possibilité qui a été présente dans la plupart des microscopes électroniques fabriqués au cours des 15 dernières années. La platine du microscope est informatisée et les images peuvent être assemblées avec un ordinateur. C’est la raison qui a conduit à faire les choix qui ont présidé à la formulation du protocole présenté.

En conclusion, nous présentons ci-dessous une série d’étapes qui donnent une plaie reproductible dans la veine ou l’artère de souris qui, ensuite, après des étapes de fixation in situ et plus tard des étapes d’encastrement, peut être visualisée par microscopie électronique à transmission à large zone à l’échelle nm et dans l’image assemblée visualisée à une échelle proche du mm, l’échelle de l’in situ réel thrombus fixe. Une telle évolutivité est nécessaire pour comprendre que la formation de thrombus est à la fois un problème d’hématologie et de santé et un système de biologie du développement dans lequel les plaquettes sont le principal type de cellule. Ces avancées offrent une vertu majeure de la microscopie électronique, à savoir que l’on voit ce qu’il y a, pas seulement ce qui s’allume. Pour un protocole détaillé sur la préparation d’échantillons pour la microscopie électronique à balayage en série (SBF-SEM), le lecteur est invité à consulter un article récent de Joshi et ^al.4.

Protocole

Les expériences ont été examinées et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Arkansas pour les sciences médicales. Ici, des souris C57BL/6 mâles et femelles de type sauvage, âgées de 8 à 12 semaines, ont été utilisées. Ces souris sont de jeunes adultes avec peu d’accumulation de graisse. Les mêmes procédures s’appliquent aux mutants murins pour diverses protéines importantes pour l’hémostase, telles que le facteur de von Willebrand ou la glycoprotéine plaquettaire VI (GPVI)^5,6. Tous les équipements, instruments chirurgicaux, réactifs et autres matériaux utilisés sont illustrés à la figure 1 et répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Plaie perforante de la veine jugulaire/de l’artère fémorale ^1,7

1. Anesthésie de la souris
   1. Placez la souris dans la chambre d’induction et tournez le vaporisateur d’isoflurane à un débit élevé (500 ml/min, 3 % d’isoflurane). L’isoflurane est choisi parce qu’il a peu d’effet sur le diamètre des vaisseaux sanguins.
      ATTENTION : Une exposition à long terme à l’isoflurane peut avoir des effets néfastes sur la santé. L’utilisation d’un vaporisateur à faible débit, de cartouches de capture de gaz d’anesthésie et d’une bonne ventilation de la pièce peut réduire considérablement l’exposition.
   2. Lorsque la souris semble endormie, pincez l’un des orteils de la souris pour voir si la souris réagit. Si c’est le cas, replacez la souris dans la chambre d’induction pendant quelques minutes, puis réessayez le test de pincement. Si la souris ne réagit pas, placez-la en position couchée sur la plaque chauffante (préalablement recouverte d’une feuille d’aluminium).
   3. Baissez le vaporisateur à un faible débit (100 ml/min, 1,75 % d’isoflurane). Placez le nez de la souris dans le cône nasal. Étendez chaque membre et fixez-le avec de petits morceaux de ruban adhésif.
   4. Insérez la sonde de température rectale et réglez la température à 37 °C sur le régulateur de température. Fixez avec du ruban adhésif le cordon de la sonde de température pour éviter qu’elle ne soit retirée accidentellement.
2. Incision de souris
   1. À l’aide de la tondeuse, rasez le cou et la poitrine de la souris (pour la veine jugulaire) ou l’intérieur de la jambe droite (pour l’artère fémorale). Essuyez les coupures de fourrure avec un tampon imbibé d’alcool. Si nécessaire, passez à nouveau sur la zone avec la tondeuse pour enlever toute fourrure restante.
   2. Essuyez à nouveau la zone avec un tampon d’alcool frais pour éliminer toutes les coupures. Il est très important que la zone soit aussi propre que possible. Confirmez le plan chirurgical de l’anesthésie par pincement des orteils.
   3. À l’aide de ciseaux et d’une pince émoussée, soulevez et coupez la peau sur la veine jugulaire droite. Découpez une fenêtre ronde dans la peau suffisamment grande pour exposer la veine jugulaire et une partie des tissus environnants.
3. Nettoyage de la veine jugulaire (les mêmes principes s’appliquent à l’artère fémorale)
   1. À l’aide de la technique de dissection émoussée, écartez doucement les ganglions adipeux et lymphatiques ainsi que le tissu conjonctif.
      REMARQUE : Un nettoyage général autour du récipient a lieu à cette étape ; Cependant, un nettoyage minutieux et approfondi aura lieu au microscope après que la veine jugulaire ait été fixée dans du paraformaldéhyde pendant 24 h.
   2. Remplissez une seringue de 20 ml avec une solution saline normale réchauffée à 37 °C. Chargez la seringue dans la pompe à perfusion de la seringue. Fixez l’aiguille papillon 27G et le tube associé à la seringue.
   3. Réglez le pousse-seringue à un débit de 0,5 mL/min. Le léger jet de solution saline éliminera le sang de la veine ou de l’artère perforée. Placez le jet de solution saline à quelques mm sur le côté du site de ponction, et non directement au-dessus de celui-ci.
4. Perforation de la veine jugulaire/artère fémorale
   1. Démarrez le minuteur. Procurez-vous une aiguille hypodermique 30G (diamètre nominal 300 μm) pour la veine jugulaire et une aiguille hypodermique 33G (200 μm de diamètre) pour l’artère fémorale. L’utilisation d’une aiguille plus petite ne donne qu’un temps de saignement légèrement plus long pour la situation artérielle à haute pression.
   2. Tournez le biseau vers le haut. Positionnez l’aiguille à un angle de 25° sur la veine jugulaire/l’artère fémorale. Notez l’heure.
   3. Percez rapidement le récipient, en vous assurant de ne percer que le haut du récipient. Veillez à ne pas percer le fond du récipient. Notez le moment où le saignement s’arrête complètement.
   4. Attendre le temps approprié pour obtenir la formation d’un thrombus (Figure 2A) avant de commencer la fixation par perfusion (c’est-à-dire 1, 5, 10 ou 20 minutes pour obtenir les différents stades de développement du thrombus). Euthanasier l’animal par exsanguination ou suivre les directives institutionnelles locales pour l’euthanasie.
5. Réalisation de la fixation de perfusion transcardique
   1. Installez la pompe péristaltique avant le début de la chirurgie. Placez deux tubes coniques de 50 ml dans un support de tube à essai. Remplir un tube avec une solution fixatrice de paraformaldéhyde à 4 % préparée dans une solution tampon de cacodylate de sodium (cacodylate de sodium 0,2 M, chlorure de sodium 0,15 M à pH 7,4) pour les études de ponction jugulaire et remplir l’autre tube avec une solution tampon de cacodylate de sodium.
      REMARQUE : Les conditions détaillées ici sont suffisantes pour le cas de basse pression de la jugulaire et sont ensuite modifiées pour le cas de pression plus élevée d’une artère. Pour les études de systèmes à haute pression avec des artères, c’est-à-dire l’artère fémorale, le fixateur de paraformaldéhyde est complété par 0,1% de glutaraldéhyde, et la fixation externe par goutte à goutte est associée à la fixation par perfusion.
   2. Placez l’extrémité d’absorption du tube de la pompe dans le tube contenant la solution tampon. Fixez une aiguille papillon 27G avec le tube associé à l’extrémité de sortie du tube de la pompe et placez l’aiguille dans un bécher propre.
   3. Réglez la pompe péristaltique sur un débit de 10 mL/min. Allumez la pompe de perfusion.
   4. Lorsque la solution tampon commence à s’écouler de l’aiguille dans le bécher, éteignez la pompe. La tubulure et l’aiguille sont maintenant prêtes pour la perfusion transcardique.
   5. Exposez la cavité thoracique en faisant une coupe médiane dans la peau du haut du sternum jusqu’à quelques millimètres au-delà du bas du sternum à l’aide de ciseaux de dissection et d’une pince émoussée. Faites des incisions transversales le long de la base de la cage thoracique, en commençant par la ligne médiane et en coupant de la médiale à la latérale de chaque côté.
   6. Immédiatement avant de commencer la perfusion transcardique, ouvrez rapidement la cage thoracique et réfléchissez chaque côté pour exposer le cœur.
   7. Allumez la pompe péristaltique. Placez la pointe de l’aiguille papillon 27G dans la base du ventricule gauche.
   8. Tout en tenant l’aiguille bien en place dans le ventricule gauche, faites une fente dans le pavillon droit à l’aide de ciseaux de dissection tranchants pour permettre au sang et au liquide de perfusion de s’écouler. Notez l’heure sur la minuterie.
   9. Perfuser avec une solution tampon pendant 3 min pour évacuer le sang du système circulatoire. Tout en maintenant l’aiguille bien en place dans le ventricule gauche, éteignez la pompe péristaltique et déplacez l’extrémité ascendante de la tubulure de la pompe péristaltique vers le tube de 50 ml contenant la solution fixatrice.
   10. Notez l’heure sur la minuterie. Allumez à nouveau la pompe péristaltique et perfuser avec la solution fixatrice pendant 7 min. Éteignez la pompe péristaltique.
   11. Retirez l’aiguille du ventricule gauche et placez-la dans un bécher à déchets. Placez l’extrémité ascendante du tube de la pompe dans un bécher d’eau distillée.
   12. Allumez la pompe péristaltique et laissez environ 20 ml d’eau s’écouler à travers le tube et sortir l’aiguille 27G dans le bécher à déchets pour nettoyer le tube. Assurez-vous de laisser toute l’eau sortir du tube et de l’aiguille avant d’éteindre la pompe.

2. Collecte d’échantillons pour la microscopie électronique

1. Après la fixation de perfusion complétée par un fixateur externe initial de 2 minutes dans le cas de plaies par perforation de l’artère fémorale, disséquez soigneusement la partie de la veine jugulaire/artère fémorale contenant le site de ponction et le thrombus (Figure 2A). Avec des ciseaux bien aiguisés, faites une coupe diagonale à l’extrémité distale du segment vasculaire et faites une coupe droite à travers l’extrémité proximale du segment vasculaire.
   REMARQUE : Faire des coupes de cette manière aide à orienter le vaisseau plus tard et à identifier la direction du flux sanguin dans le vaisseau.
2. Immergez le segment du récipient dans du paraformaldéhyde frais à 4 % à température ambiante dans une solution tampon de cacodylate de sodium (0,2 M de cacodylate de sodium, 0,15 M de chlorure de sodium à pH 7,4) et placez-le à température ambiante pendant 1 h.
3. Transférez le tissu fixé à 4 °C pendant 24 h. Le lendemain, prenez une boîte de culture de 35 mm contenant un tapis en silicone de ~5 mm d’épaisseur (préparé à l’avance selon les instructions du fabricant). Versez suffisamment de solution tampon de cacodylate de sodium dans la boîte pour immerger le segment de veine fixe.
4. Lors de l’observation au microscope optique (grossissement ~15x), transférez soigneusement le tissu dans la boîte de 35 mm contenant la solution tampon et épinglez chaque extrémité du récipient sur le tapis en silicone à l’aide de broches minutiennes en acier inoxydable et de pinces fines.
5. Nettoyez soigneusement le segment de la veine jugulaire/de l’artère fémorale à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince très fine.
   1. Pour la veine jugulaire uniquement : Retirez l’une des broches et, à l’aide des micro-ciseaux, coupez la paroi du vaisseau en face du site de ponction/thrombus dans le sens de la longueur. Ouvrez doucement le récipient et, à l’aide de 4 à 5 broches (chacune coupée en deux avec une pince coupante), épinglez-le sur le tapis de silicone avec le côté intraluminal vers le haut.
6. Aspirez la solution tampon, remplacez-la rapidement par une solution de paraformaldéhyde à 1 % dans une solution tampon de cacodylate de sodium et placez le couvercle sur le plat. Ne laissez pas le tissu se dessécher à tout moment. Gardez-le toujours immergé dans le liquide.
7. Conservez le tissu à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit temps de le traiter pour la microscopie électronique (Figure 2B). Traiter certains échantillons de plaies par perforation de la veine jugulaire et de l’artère fémorale pour l’imagerie par SBF-SEM⁴ et d’autres pour l’imagerie par WA-TEM ^8,9. Les étapes de la WA-TEM sont décrites en détail ci-dessous.
   ATTENTION : Effectuez tous les travaux impliquant du formaldéhyde, de l’oxyde de propylène, de l’OsO₄ et du 2,4,6-Tris(diméthylaminométhyl)phénol (DMP-30) dans une hotte chimique. Ce sont des produits chimiques dangereux. L’exposition à OsO₄ peut provoquer la cécité et la mort.
   REMARQUE : Tous les volumes de rinçage et de coloration sont au moins 2 fois le volume de l’échantillon. La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x peut être substituée au tampon cacodylate de sodium 0,1 M. Pendant la procédure de fixation, il est très important de ne jamais laisser les échantillons se dessécher, car cela affecterait considérablement l’ultrastructure. Utilisez des tubes en polypropylène.

3. Préparation de l’échantillon pour la microscopie électronique à transmission à large zone (WA-TEM)

REMARQUE : Cette étape représente un point de décision auquel l’enquêteur s’engage à se préparer pour WA-TEM. Cette procédure préparatoire ne prend pas en charge le SBF-SEM. Pour le SBF-SEM volume EM, toutes les colorations doivent être effectuées avant l’enrobage dans le plastique. Veuillez voir⁴ pour un protocole de préparation SBF-SEM.

1. Lavez l’échantillon de tissu dans la boîte de 35 mm 2 fois avec la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) ou le PBS à température ambiante (RT). Gardez l’échantillon épinglé, ce qui permet de suivre l’orientation de l’échantillon à travers ces étapes de préparation.
2. Fixer avec 0,8 mL de 0,05 % de vert de malachite / 2,5 % de glutaraldéhyde / 0,1 M de cacodylate de sodium (pH 6,7 - 7,0) pendant 20 min sur glace.
3. Retirer le fixateur et laver l’échantillon 4 fois pendant 5 minutes chacune avec 0,1 M de cacodylate de sodium. Retirer le cacodylate de sodium 0,1 M.
4. Postfix avec 0,8 mL de 0,8 % de K₃Fe(CN)₆ ou de K₄Fe(CN)₆ / 1,0 % d’OsO₄ K₃Fe(CN)₆ dans 0,1 M de cacodylate de sodium. Placez un couvercle sur le plat pour empêcher la lumière d’entrer (OsO₄ est sensible à la lumière). Colorer pendant 20 min à 1 h à RT.
5. Retirez l’OsO₄ et rincez-le 4 fois pendant 5 minutes chacun avec un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M. Retirer le tampon de cacodylate de sodium et colorer avec de l’acide tannique à 1 % pendant 20 minutes sur de la glace.
6. Retirer l’acide tannique et laver pendant 5 min avec un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M 1x et 2x pendant 5 min chacun avec de l’eau distillée de qualité moléculaire (DI).
7. Colorer avec de l’acétate d’uranyle à 0,5 % (UA) pendant 1 h RT ou une nuit à 4 °C dans l’obscurité.
8. Retirez l’acétate d’uranyle et rincez 5 fois pendant 5 minutes chacune avec de l’eau distillée de qualité moléculaire. Avant le dernier lavage et pendant que l’échantillon est encore immergé dans de l’eau DI, coupez le tapis de silicone autour de l’échantillon épinglé avec une lame de rasoir. Soulevez ce petit morceau de tapis en silicone de la plaque et placez-le dans un tube en polypropylène.
   REMARQUE : Il est important que l’échantillon reste épinglé à la pièce de silicone lorsqu’il est dans le tube. Le passage aux tubes en polypropylène dans cette étape est nécessaire car l’oxyde de propylène utilisé dans les étapes suivantes dégradera le polystyrène des plaques de 35 mm.
9. Après avoir retiré le dernier tampon, rincez brièvement 1x avec de l’éthanol à 25%. Jetez l’éthanol à 25 % et incubez avec de l’éthanol à 25 % pendant 3 min sur de la glace.
10. Retirez l’éthanol à 25 %. Rincer brièvement 1x avec de l’éthanol à 50%. Jetez l’éthanol à 50 % et incubez avec de l’éthanol à 50 % pendant 3 minutes sur de la glace.
11. Retirez l’éthanol à 50 % et rincez brièvement 1 fois avec de l’éthanol à 75 %. Jetez l’éthanol à 75 % et incubez avec de l’éthanol à 75 % pendant 3 min sur de la glace.
12. Retirez l’éthanol à 75 % et rincez brièvement 1 fois avec de l’éthanol à 95 %. Jetez l’éthanol à 95 % et incubez avec de l’éthanol à 95 % pendant 3 minutes sur de la glace.
13. Retirez l’éthanol à 95 % et lavez 3 fois, au moins 10 min à chaque fois, avec de l’éthanol à 100 % (200 proof). Retirez l’éthanol à 100 % et ajoutez l’oxyde de propylène (PO). Rincer 3x au moins 10 min chacun, avec PO.
14. Préparez le mélange de résine comme décrit ci-dessous.
    1. Réchauffez les composants en résine à 60 °C pour qu’ils se liquéfient complètement. Bien mélanger 12,5 ml d’Embed-218, 7,5 ml d’Araldite 502 et 27,5 ml de DDSA dans un tube de 50 ml à 60 °C. Ce mélange se conserve 6 mois à 4 °C. Réchauffez-le à 60 °C avant de l’utiliser. Aliquote la quantité requise avant utilisation.
15. Intégrez les exemples comme décrit ci-dessous.
    1. Placez une partie aliquote du mélange de résine dans un tube et ajoutez 20 μL/mL d’activateur DMP-30. Bien mélanger en tournant à 60 °C ; La couleur devrait s’assombrir.
    2. Diluez cette aliquote de résine activée à 50% dans du PO et laissez la résine et le PO se mélanger complètement.
    3. Retirez le dernier rinçage PO du tube contenant l’échantillon et remplacez-le par le mélange 50 % de résine/PO, en remplissant presque complètement le tube. Faites pivoter l’échantillon pendant la nuit à température ambiante.
    4. Le lendemain, mélanger une nouvelle aliquote de résine (1 mL par échantillon) avec 20 μL/mL de DMP-30.
16. Placez l’échantillon dans une boîte en polypropylène avec un petit volume de mélange de résine et de PO à 50 % du tube d’échantillon sous un microscope à dissection (grossissement ~6x) et retirez soigneusement les broches du tissu. Transférez uniquement le tissu dans une autre boîte en polypropylène contenant une petite quantité de résine à 100 % avec un activateur DMP-30.
17. Remplissez un moule d’enrobage en silicone avec la résine à 100% avec l’activateur DMP-30 et placez soigneusement l’échantillon dans le moule. Mettre le moule au four et cuire à 60 °C pendant au moins 48 h. L’échantillon préparé est illustré à la figure 2B.
18. Effectuez une imagerie par microscopie électronique à transmission large zone (WA-TEM) comme décrit en^10,11. Voir la figure 3 pour une représentation du processus allant d’une ponction initiale à un thrombus de 1 minute rendu en 3 dimensions. L’inclusion d’un protocole détaillé pour l’imagerie par microscopie électronique WA-TEM montée n’est pas incluse ici et dépasse le cadre des protocoles actuels sur la préparation des échantillons.
    REMARQUE : Le WA-TEM est une capacité sous-estimée de la plupart des microscopes électroniques à transmission modernes dotés d’une platine informatisée. Un logiciel shareware prenant en charge ces fonctions^10,11 est disponible auprès du groupe du Dr David Mastronarde, Université du Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Résultats

Quantification des effets du médicament sur le temps de saignement de la plaie perforante
Les temps de saignement des plaies par perforation fournissent un modèle physiologique d’un risque médicamenteux qui peut être facilement réalisé chez la souris. Les résultats qui découlent d’une expérience de plaie perforante sont prédictifs. Ici, nous montrons une courbe d’hémorragie dose-réponse dabigatran. Le dabigatran, un inhibiteur de la thrombine, est ut...

Discussion

Nous présentons une procédure détaillée de plaie perforante pour produire des thrombus hémostatiques dans les veines jugulaires et les artères fémorales, leur fixation par perfusion in situ et le traitement d’échantillons pour la microscopie électronique à transmission à large zone montée. L’ensemble des procédures est utile pour générer des thrombus hémostatiques pour l’analyse ultrastructurale et pour comparer les temps de saignement chez les souris expé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000