Hémostase de la plaie perforante et préparation d’échantillons pour l’analyse par microscopie électronique à large rayon

Résumé

Une procédure de plaie perforante pour la formation de thrombus hémostatiques est présentée ici. Les thrombus formés sont grands et ont des centaines de microns de diamètre. Par conséquent, les approches d’imagerie volumique sont appropriées. Nous suggérons la microscopie électronique à transmission à large zone comme approche à haute résolution accessible au plus grand nombre et détaillons un protocole préparatif.

Résumé

L’hémostase, le processus de contrôle physiologique normal des lésions vasculaires, est fondamentale pour la vie humaine. Nous souffrons tous de coupures mineures et de blessures par perforation de temps en temps. Dans l’hémostase, l’agrégation plaquettaire auto-limitante conduit à la formation d’un thrombus structuré dans lequel l’arrêt du saignement provient du recouvrement du trou par l’extérieur. Une caractérisation détaillée de cette structure pourrait conduire à des distinctions entre l’hémostase et la thrombose, un cas d’agrégation plaquettaire excessive conduisant à une coagulation occlusive. Une approche basée sur l’imagerie de la structure du thrombus de la plaie perforante est présentée ici qui s’appuie sur la capacité de la microscopie électronique à section mince à visualiser l’intérieur des thrombus hémostatiques. L’étape la plus fondamentale de tout protocole expérimental basé sur l’imagerie est une bonne préparation des échantillons. Le protocole fournit des procédures détaillées pour préparer les plaies par perforation et les thrombus riches en plaquettes chez la souris pour la microscopie électronique ultérieure. Une procédure détaillée est donnée pour la fixation in situ du thrombus de la plaie perforante en formation et son traitement ultérieur pour la coloration et l’enrobage pour la microscopie électronique. La microscopie électronique est présentée comme la technique d’imagerie finale en raison de sa capacité, lorsqu’elle est combinée à une coupe séquentielle, à visualiser les détails de l’intérieur du thrombus à haute résolution. En tant que méthode d’imagerie, la microscopie électronique permet d’obtenir un échantillonnage non biaisé et un résultat expérimental qui s’échelonne du nanomètre au millimètre en 2 ou 3 dimensions. Nous citons un logiciel gratuit de microscopie électronique approprié qui prendra en charge la microscopie électronique à grande échelle dans laquelle des centaines d’images peuvent être mélangées pour donner une imagerie à l’échelle nanométrique de sections efficaces entières de thrombus de plaie perforante. Par conséquent, n’importe quelle sous-région du fichier image peut être facilement placée dans le contexte de la section transversale complète.

Introduction

La formation d’un thrombus perforant qui conduit à l’arrêt de l’hémorragie est l’un des événements les plus essentiels de la vie¹. Pourtant, malgré cette essentialité, la connaissance de ce qui se passe structurellement lors de la formation d’un thrombus, que ce soit dans une veine, une artère, un événement athérosclérotique ou un caillot occlusif, a été limitée par la résolution et la profondeur de l’imagerie. La microscopie optique conventionnelle est limitée en profondeur par rapport à un thrombus de plaie perforante entièrement formé, de 200 à 300 μm en Z¹, et en niveau de résolution....

Protocole

Les expériences ont été examinées et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Arkansas pour les sciences médicales. Ici, des souris C57BL/6 mâles et femelles de type sauvage, âgées de 8 à 12 semaines, ont été utilisées. Ces souris sont de jeunes adultes avec peu d’accumulation de graisse. Les mêmes procédures s’appliquent aux mutants murins pour diverses protéines importantes pour l’hémostase, telles que le facteur de von Willebrand ou la glycoprotéine plaquettaire VI (GPVI)^5,6. Tous les équipements, instruments chirurgicaux, ré....

Discussion

Nous présentons une procédure détaillée de plaie perforante pour produire des thrombus hémostatiques dans les veines jugulaires et les artères fémorales, leur fixation par perfusion in situ et le traitement d’échantillons pour la microscopie électronique à transmission à large zone montée. L’ensemble des procédures est utile pour générer des thrombus hémostatiques pour l’analyse ultrastructurale et pour comparer les temps de saignement chez les souris expé.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000