Test de complémentation basé sur Escherichia coli pour étudier la fonction chaperonne de la protéine de choc thermique 70

Résumé

Ce protocole démontre l’activité chaperonne de la protéine de choc thermique 70 (Hsp70). Les cellules E. coli dnaK756 servent de modèle pour le test car elles hébergent un Hsp70 natif et fonctionnellement altéré, ce qui les rend sensibles au stress thermique. L’introduction hétérologue de Hsp70 fonctionnel sauve le déficit de croissance des cellules.

Résumé

La protéine de choc thermique 70 (Hsp70) est une protéine conservée qui facilite le repliement d’autres protéines dans la cellule, ce qui en fait un chaperon moléculaire. Bien que Hsp70 ne soit pas essentiel à la croissance des cellules E. coli dans des conditions normales, ce chaperon devient indispensable pour la croissance à des températures élevées. Comme Hsp70 est hautement conservé, une façon d’étudier la fonction chaperon des gènes Hsp70 de diverses espèces est de les exprimer de manière hétérologue dans des souches d’E. coli qui sont soit déficientes en Hsp70, soit expriment une Hsp70 native qui est fonctionnellement compromise. Les cellules E. coli dnaK756 sont incapables de supporter l’ADN bactériophage λ. De plus, leur Hsp70 natif (DnaK) présente une activité ATPase élevée tout en démontrant une affinité réduite pour GrpE (facteur d’échange nucléotidique Hsp70). En conséquence, les cellules E. coli dnaK756 se développent correctement à des températures allant de 30 °C à 37 °C, mais elles meurent à des températures élevées (>40 °C). Pour cette raison, ces cellules servent de modèle pour étudier l’activité chaperonne de Hsp70. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’application de ces cellules afin de réaliser un test de complémentation, permettant d’étudier la fonction chaperonne in cellulo de Hsp70.

Introduction

Les protéines de choc thermique jouent un rôle important en tant que chaperons moléculaires en facilitant le repliement des protéines, en empêchant l’agrégation des protéines et en inversant le mauvais repliement des protéines ^1,2. La protéine de choc thermique 70 (Hsp70) est l’un des chaperons moléculaires les plus importants, jouant un rôle central dans l’homéostasie des protéines ^3,4. DnaK est l’homologue⁵ d’E. coli Hsp70.

Divers tests biophysiques, biochimiques et cellulaires ont été mis ....

Protocole

1. Transformation

REMARQUE : Utilisez de la verrerie stérile pour la culture, des pointes de pipette et des milieux fraîchement préparés et autoclavés. Préparez des cultures de cellules d’E. coli dans 2x gélose tryptone de levure (YT) [1,6 % de tryptone (p/v), 1 % d’extrait de levure (p/v), 0,5 % de NaCl (p/v), 1,5 % de gélose (p/v)]. Les réactifs généraux utilisés dans le protocole et leurs sources sont indiqués dans la table des matières.

1. Étiqueter les tubes de microcentrifugation de 2,0 mL et aliquote 50 μL de cellules E. coli dnaK756compétentes, en gardant les cellules sur la....

Discussion

Le protocole démontre l’utilité des cellules E. coli dnaK756dans l’exploration de la fonction chaperon de Hsp70 exprimée de manière hétérologue. Ce test pourrait être adopté pour cribler les inhibiteurs ciblant la fonction de Hsp70 dans le cellulo. Cependant, l’une des limites de cette méthode est que les Hsp70 incapables de remplacer le DnaK dans E. coli ne sont pas compatibles avec ce test. L’absence de modification post-traductionnelle²¹ de certains H.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Constituent for sample loading dye
Acetic acid	Labchem	101005125	Constituent of destainer
Acrylamide	Sigma-Aldrich	8008300100	Component of SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	Constituent of medium and liquid growth assay
Agarose	Clever Scientific	14131031	Certified molecular biology agarose
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	101875295	Constituent for SDS-PAGE gel
Ampicillin	VWR International	0339—EU—25G	Selective antibiotic
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Component of SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Constituent for sample loading dye
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	For competent cells preparation
Coomassie brilliant blue	VWR International	443293X	SDS-PAGE dye
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	RB10368	Constituent of PBS buffer
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Western blot detection reagent
Ethidium Bromide	Thermofischer Scientific	17898	DNA intercalating dye
Glycerol	Merck	SAAR2676520L	Constituent for sample loading dye
Glycine	VWR International	10119CU	Component of SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	inducer
Kanamycin	Melford	K0126	Selective antibiotic
Magnesium Chloride	Merck	SAAR4123000EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Methanol	Labchem	113140129	Constituent of destainer
Monobasic potassium phosphate	Merck	1,04,87,30,250	Constituent of PBS buffer
Peptone	Merck	HG000BX4.250	Constituent of medium and liquid growth assay
Potassium chloride	Merck	SAAR5042020EM	Constituent of PBS buffer
PVDF membrane	Thermofischer scientific	PB7320	Western blot membrane
Sodium Chloride	Merck	SAAR5822320EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Sodium dodecyl sulphate	VWR International	108073	To resolve expressed proteins
Spectramax iD3	Separations	373705019	Automated plate reader
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Component of SDS gel
Tetracycline	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Selective antibiotic
Tris	VWR International	19A094101	Component of SDS gel
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Constituent for Western wash buffer
Western transfer chamber	Thermofisher Scientific	PB0112	Transfer of protein to nitrocellulose membrane
Yeast extract	Merck	HG000BX6.500	Constituent of medium and liquid growth assay
α-DnaK antibody	Inqaba	BK CAC09317	Primary antibody
α-rabbit antibody	Thermofischer scientific	31460	Secondary antibody