Séparation et affichage rapides d’agents fibrinogénolytiques actifs chez Sipunculus nudus par électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide

Résumé

Ici, nous présentons un protocole d’électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide (PAGE) pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques de Sipunculus nudus.

Résumé

Les agents fibrinogénolytiques capables de dissoudre directement le fibrinogène ont été largement utilisés dans le traitement anticoagulant. Généralement, l’identification de nouveaux agents fibrinogénolytiques nécessite d’abord la séparation de chaque composant, puis la vérification de leurs activités fibrinogénolytiques. Actuellement, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) et la chromatographie sont principalement utilisées dans l’étape de séparation. Pendant ce temps, le dosage sur plaque de fibrinogène et les produits de réaction PAGE sont généralement adoptés pour montrer leurs activités fibrinogénolytiques. Cependant, en raison de la séparation spatio-temporelle de ces deux étapes, il est impossible de séparer et d’afficher les agents fibrinogénolytiques actifs avec le même gel. Pour simplifier les processus de séparation et d’affichage de l’identification des agents fibrinogénolytiques, nous avons construit une nouvelle méthode fibrinogène-PAGE pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques des vers d’arachide (Sipunculus nudus) dans cette étude. Cette méthode comprend la préparation de fibrinogène-PAGE, l’électrophorèse, la renaturation, l’incubation, la coloration et la décoloration. L’activité fibrinogénolytique et le poids moléculaire de la protéine peuvent être détectés simultanément. Selon cette méthode, nous avons réussi à détecter plus d’un agent fibrinogénolytique actif de l’homogénate de ver de l’arachide en 6 heures. De plus, cette méthode fibrinogen-PAGE est rapide et économique. De plus, cette méthode pourrait être utilisée pour étudier les agents fibrinogénolytiques des autres organismes.

Introduction

Ces dernières années, en raison de l’augmentation continue des maladies thrombotiques, les maladies thrombotiques sont devenues un nouveau problème majeur de santé mondiale¹. À l’heure actuelle, les médicaments antithrombotiques sont classés en trois groupes : les médicaments anti-agrégation plaquettaire, les anticoagulants et les médicaments thrombolytiques. Parmi eux, les médicaments thrombolytiques, tels que l’urokinase (Royaume-Uni), l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), etc., sont les seuls médicaments utilisés en clinique qui peuvent hydrolyser le thrombus². Parallèlement, des médicaments thrombolytiques plus sûrs et plus efficaces sont mis au point grâce à l’identification de nouveaux agents thrombolytiques³.

Cependant, l’identification de nouveaux agents thrombolytiques prend du temps et demande beaucoup de main-d’œuvre, ce qui implique principalement les étapes de séparation/purification et de caractérisation/vérification. La première consiste à séparer chaque composant, et la seconde à afficher leurs activités fibrino(géno)lytiques ^4,5. Dans des études précédentes, malgré le fait que nous ayons réussi à isoler une nouvelle enzyme fibrino(géno)lytique (sFE) du ver de l’arachide (Sipunculus nudus) par chromatographie d’affinité et dosage de la plaque de fibrine (ogène) ^6,7,8, ces processus prennent beaucoup de temps et de main-d’œuvre. Tout d’abord, il est nécessaire de déterminer si les homogénats de ver d’arachide ont une activité fibrino(géno)lytique par la méthode sur plaque de fibrine(ogène) et les produits de réaction basés sur la PAGE⁹. Ensuite, une série de chromatographies, telles que la chromatographie d’échange d’ions, la chromatographie de filtration sur gel, la chromatographie d’affinité et d’autres méthodes, doivent être effectuées pour la séparation et la purification^10,11. Par la suite, le dosage de la plaque de fibrine est effectué à nouveau pour vérifier l’activité fibrinogénolytique de chaque composant séparé. Enfin, la PAGE native et le dodécylsulfate de sodium (SDS) sont réalisés pour déterminer le poids moléculaire des agents fibrinogénolytiques actifs¹². Par conséquent, il est essentiel de séparer et d’afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques actifs.

Pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques actifs dans les homogénats de vers d’arachide, une nouvelle méthode fibrinogène-PAGE a été développée en combinant les méthodes PAGE et sur plaque de fibrinogène, c’est-à-dire que les substrats des agents fibrinolytiques fibrinolytiques ont été ajoutés au gel natif-PAGE. Après native-PAGE, les composants ont été séparés en fonction de leur poids moléculaire. Pendant ce temps, chaque composant fibrinogénolytique actif peut être mis en évidence par coloration. Grâce à cette méthode, nous avons réussi à détecter plus d’un agent fibrinogénolytique actif de l’homogénat du ver de l’arachide en 6 heures. De plus, cette méthode fibrinogen-PAGE est rapide et économique. De plus, cette méthode pourrait être utilisée pour étudier les agents fibrinogénolytiques des autres organismes.

Protocole

1. Préparation de l’homogénat du ver d’arachide

1. Ajouter 50 g de vers d’arachide et 150 ml de solution saline dans l’homogénéisateur.
2. Homogénéiser à 24000 tr/min pendant 60 s.
   REMARQUE : Répétez 3 fois.
3. Centrifuger l’homogénat à 9710 x g pendant 30 min à 4 °C.
4. Prélever le surnageant sous forme d’homogénat de vers d’arachide pour une étude plus approfondie.

2. Préparation du gel Fibrinogen-PAGE

1. Peser 0,01 g de fibrinogène dans un bécher en verre de 50 ml.
2. Ajouter 1,9 mL de DDH₂O, 1,3 mL de Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) et 0,05 mL de SDS (10 %, p/v) dans le bécher ; Bien mélanger par pipetage.
3. Placez le bécher à 37 °C pendant 30 min.
   REMARQUE : Cette étape consiste à dissoudre le fibrinogène.
4. Ajouter 1,7 mL d’acrylamide (30 %, p/v), 0,05 mL de persulfate d’ammonium (APS ; 10 %, p/v), 0,002 mL de TEMED ; Bien mélanger par pipetage.
   REMARQUE : Il s’agit d’un gel de séparation.
5. Versez le gel de séparation dans un moule à gel de 10 puits.
6. Ajouter 2 mL de DDH₂O dans le moule à gel ; Attendez 30 min.
7. Retirez soigneusement l’eau en retournant le moule.
8. Ajouter 1,4 mL de DDH₂O, 0,25 mL de Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 mL de SDS (10 %, p/v), 0,33 mL d’acrylamide (30 %, p/v), 0,02 mL d’APS (10 %, p/v), 0,002 mL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans le bécher ; Bien mélanger par pipetage.
   REMARQUE : Il s’agit d’un gel de chargement.
9. Versez le gel de chargement dans le même moule à gel que à l’étape 2.5 ; Insérez le peigne immédiatement.
   REMARQUE : Le gel fibrinogène-PAGE utilisé ici était composé du fibrinogène (0,2 %) contenant du gel séparateur et du gel de charge. La concentration de fibrinogène peut être ajustée au besoin.

3. Électrophorèse

1. Placez le gel fibrinogen-PAGE préparé avec le moule à colle dans le réservoir d’électrophorèse ; verser 1300 mL de solution d’électrophorèse (1,963 g de Tris, 12,22 g de glycine, 0,65 g de SDS et 1300 mL de DDH₂O) dans le réservoir ; Sortez le peigne.
2. Ajouter 5 μL de tampon de charge 5x non dénaturant aux 20 μL de sFE et 20 μL d’homogénat de ver d’arachide ; bien mélanger par pipetage ; les charger dans le gel fibrinogen-PAGE préparé.
   REMARQUE : Ne faites pas bouillir le mélange. sFE est une enzyme fibrino(géno)lytique identifiée précédemment ^6,7,8 et est utilisée comme contrôle positif dans cette étude. L’homogénat de ver de l’arachide est l’échantillon à détecter. Tampon de charge non dénaturant sans bleu de bromophénol, β-mercaptoéthanol et SDS par rapport au tampon de chargement SDS-PAGE. Chaque voie d’échantillonnage est séparée par le tampon de chargement SDS-PAGE 1x pour détecter clairement le mouvement de la protéine.
3. Effectuez une électrophorèse à 80 V pendant 30 min, ou à 120 V pendant 20 min.
4. Retirez le gel fibrinogen-PAGE du moule à colle.

4. Renaturation

1. Transférez le gel fibrinogen-PAGE dans une boîte en plastique.
2. Ajoutez 100 ml de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) et 2 ml de Triton X-100 dans la boîte. Placez-le sur un shaker à 60-70 tr/min pendant 10 min.
3. Retirez le tampon de lavage par pipetage.
   REMARQUE : Répétez trois fois.

5. Incubation

1. Ajouter 50 ml de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) dans la boîte en plastique.
2. Incuber à 37 °C pendant 4 h.
   REMARQUE : Le temps d’incubation peut être ajusté en fonction de l’intensité de l’activité fibrinogénolytique.

6. Coloration

1. Retirez le tampon d’incubation par pipetage.
2. Ajoutez 50 ml de solution de coloration Coomassie Brillant Blue dans la boîte et placez la boîte sur un agitateur à 60-70 tr/min pendant 30 min.

7. Décoloration

1. Retirez la solution colorante par pipetage.
2. Ajouter 50 ml de DDH₂O dans la boîte.
3. Placez la boîte sur un shaker à 60-70 tr/min pendant 30 min.
   REMARQUE : DD H₂O a été utilisé ici comme solution de décoloration. Le temps d’agitation peut être ajusté en fonction de l’intensité de l’activité fibrinogénolytique.

Résultats

Après électrophorèse, toutes les bandes du marqueur ont été clairement affichées. Les 1x voies de chargement SDS-PAGE n’affichaient que des bandes de 10 kDa (bleu de bromophénol). Les échantillons de sFE et de vers d’arachide n’ont montré aucune bande observable (figure 1). Bien que les bandes des échantillons ne soient pas visibles, les performances du marqueur et du bleu de bromophénol ont indiqué que l’électrophorèse a été réussie...

Discussion

sFE est une nouvelle enzyme fibrino(géno)lytique isolée à partir de vers d’arachide par notre équipe précédemment 3,6,8,13. Cependant, les processus d’identification de la sFE prenaient du temps et de la main-d’œuvre, impliquant la détection de l’activité fibrinogénolytique, la séparation des composants protéiques et les étapes de confirmat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200