Microscopie intravitale à deux photons du poumon de souris transplanté

Résumé

Ici, nous présentons un protocole d’imagerie intravitale du poumon gauche de souris transplantée à l’aide de la microscopie à deux photons. Il s’agit d’un outil précieux pour étudier la dynamique cellulaire et les interactions en temps réel après une transplantation pulmonaire murine.

Résumé

Les complications après une transplantation pulmonaire sont en grande partie liées à la réponse du système immunitaire de l’hôte à la greffe. Ces réponses immunitaires sont régulées par la diaphonie entre les cellules donneuses et receveuses. Une meilleure compréhension de ces processus repose sur l’utilisation de modèles animaux précliniques et est facilitée par une capacité à étudier le trafic de cellules immunitaires intra-greffe en temps réel. La microscopie intravitale à deux photons peut être utilisée pour imager des tissus et des organes à des profondeurs allant jusqu’à plusieurs centaines de microns avec un minimum de photodommages, ce qui offre un grand avantage par rapport à la microscopie confocale monophotonique. L’utilisation sélective de souris transgéniques avec une expression de protéine fluorescente spécifique du promoteur et/ou le transfert adoptif de cellules marquées à un colorant fluorescent pendant la microscopie intravitale à deux photons permet l’étude dynamique de cellules uniques dans leur environnement physiologique. Notre groupe a mis au point une technique pour stabiliser les poumons de souris, ce qui nous a permis d’imager la dynamique cellulaire dans des poumons naïfs et des greffons pulmonaires transplantés orthotopiquement. Cette technique permet d’évaluer en détail le comportement cellulaire dans le système vasculaire et dans l’interstitium, ainsi que d’examiner les interactions entre diverses populations cellulaires. Cette procédure peut être facilement apprise et adaptée pour étudier les mécanismes immunitaires qui régulent les réponses inflammatoires et tolérogènes après une transplantation pulmonaire. Il peut également être étendu à l’étude d’autres affections pulmonaires pathogènes.

Introduction

La transplantation pulmonaire est la dernière option pour de nombreux patients souffrant d’une maladie pulmonaire en phase terminale ; Cependant, la survie à long terme après une transplantation pulmonaire est faible par rapport à d’autres greffes d’organes solides. La survie à 5 ans n’est que de ~60 %-70 %¹, contre 80 %-90 % dans le cœur² et 85 %-90 % dans les reins³. De nombreuses complications après une transplantation pulmonaire, telles que le dysfonctionnement primaire du greffon, le rejet médié par les anticorps et le dysfonctionnement chronique de l’allogre....

Protocole

Toutes les procédures de manipulation des animaux ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals et approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université de Washington.

1. Anesthésie et intubation

REMARQUE : Une greffe orthotopique du poumon gauche de souris est effectuée, comme décrit précédemment^20,21. Des poumons de souris C57BL/6 (B6) de 20 à 25 g sont transplantés chez d....

Discussion

L’excitation à deux photons a été décrite pour la première fois dans sa thèse de doctorat par Maria Göppert-Mayer en 1931, qui a ensuite remporté le prix Nobel de physique pour avoir décrit la structure de la coquille nucléaire^22,23. La microscopie à fluorescence traditionnelle repose sur l’excitation d’un seul photon, avec des longueurs d’onde d’excitation plus courtes et une énergie plus élevée que les l.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control