Microscopie intravitale à deux photons du poumon de souris transplanté

Résumé

Ici, nous présentons un protocole d’imagerie intravitale du poumon gauche de souris transplantée à l’aide de la microscopie à deux photons. Il s’agit d’un outil précieux pour étudier la dynamique cellulaire et les interactions en temps réel après une transplantation pulmonaire murine.

Résumé

Les complications après une transplantation pulmonaire sont en grande partie liées à la réponse du système immunitaire de l’hôte à la greffe. Ces réponses immunitaires sont régulées par la diaphonie entre les cellules donneuses et receveuses. Une meilleure compréhension de ces processus repose sur l’utilisation de modèles animaux précliniques et est facilitée par une capacité à étudier le trafic de cellules immunitaires intra-greffe en temps réel. La microscopie intravitale à deux photons peut être utilisée pour imager des tissus et des organes à des profondeurs allant jusqu’à plusieurs centaines de microns avec un minimum de photodommages, ce qui offre un grand avantage par rapport à la microscopie confocale monophotonique. L’utilisation sélective de souris transgéniques avec une expression de protéine fluorescente spécifique du promoteur et/ou le transfert adoptif de cellules marquées à un colorant fluorescent pendant la microscopie intravitale à deux photons permet l’étude dynamique de cellules uniques dans leur environnement physiologique. Notre groupe a mis au point une technique pour stabiliser les poumons de souris, ce qui nous a permis d’imager la dynamique cellulaire dans des poumons naïfs et des greffons pulmonaires transplantés orthotopiquement. Cette technique permet d’évaluer en détail le comportement cellulaire dans le système vasculaire et dans l’interstitium, ainsi que d’examiner les interactions entre diverses populations cellulaires. Cette procédure peut être facilement apprise et adaptée pour étudier les mécanismes immunitaires qui régulent les réponses inflammatoires et tolérogènes après une transplantation pulmonaire. Il peut également être étendu à l’étude d’autres affections pulmonaires pathogènes.

Introduction

La transplantation pulmonaire est la dernière option pour de nombreux patients souffrant d’une maladie pulmonaire en phase terminale ; Cependant, la survie à long terme après une transplantation pulmonaire est faible par rapport à d’autres greffes d’organes solides. La survie à 5 ans n’est que de ~60 %-70 %¹, contre 80 %-90 % dans le cœur² et 85 %-90 % dans les reins³. De nombreuses complications après une transplantation pulmonaire, telles que le dysfonctionnement primaire du greffon, le rejet médié par les anticorps et le dysfonctionnement chronique de l’allogreffe pulmonaire, sont dues à la réponse immunitaire de l’hôte à l’allogreffe. Par exemple, notre groupe a montré que les neutrophiles sont rapidement recrutés dans l’allogreffe pulmonaire après une lésion d’ischémie-reperfusion induite par une greffe et forment des amas dynamiques autour des monocytes sanguins⁴. La diaphonie entre les cellules du donneur et du receveur est responsable des réponses allo-immunes délétères ^5,6,7, et la capacité d’étudier ces interactions cellulaires dynamiques dans un modèle animal vivant est inestimable.

La microscopie à deux photons permet une imagerie intravitale haute résolution pour des profondeurs allant jusqu’à plusieurs centaines de microns avec un photoblanchiment minimal des tissus ^8,9. Il est utilisé dans une variété de tissus et de sites anatomiques, y compris le néocortex^10,11, la peau^12,13 et le rein^14,15. Plus récemment, il a été adapté à des organes non statiques tels que le poumon et le cœur ^4,16,17. Dans ce protocole, nous décrivons une technique permettant d’imager des greffons pulmonaires stabilisés, ventilés et perfusés après une transplantation orthotopique murine du poumon gauche. L’un des principaux avantages du modèle de transplantation est la possibilité de manipuler génétiquement le donneur et le receveur séparément. Des populations cellulaires individuelles peuvent être visualisées avec des souches de souris transgéniques avec une expression de protéine fluorescente knock-in, un transfert adoptif de cellules marquées par fluorescence⁵ ou une injection intraveineuse d’anticorps marqués par fluorescence pour lier des marqueurs spécifiques aux cellules 4,16,17,18.

Afin de stabiliser le poumon pendant l’imagerie, ce protocole consiste à coller le poumon à un couvre-verre, tandis que d’autres groupes ont décrit la stabilisation de l’aspiration à l’aide d’un dispositif d’aspiration réversible sur mesure¹⁹. Notre protocole présente plusieurs avantages, notamment une plus grande zone d’imagerie et une relative facilité d’installation en utilisant des matériaux couramment disponibles dans un laboratoire de microscopie (y compris le verre de protection et la colle). Étant donné que cette technique de collage contraint le poumon au niveau de la surface supérieure, on s’attend à ce qu’elle diminue le mouvement ventilatoire et permette une imagerie plus profonde. Cette technique d’imagerie intravitale permet d’observer en temps réel le comportement et les interactions des cellules immunitaires, ce qui contribue à l’étude des mécanismes immunitaires qui régulent les réponses inflammatoires par rapport aux réponses tolérogènes après une transplantation pulmonaire.

Protocole

Toutes les procédures de manipulation des animaux ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals et approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université de Washington.

1. Anesthésie et intubation

REMARQUE : Une greffe orthotopique du poumon gauche de souris est effectuée, comme décrit précédemment^20,21. Des poumons de souris C57BL/6 (B6) de 20 à 25 g sont transplantés chez des receveurs de B6 appariés selon le sexe et l’âge. N° B6. Les souris rapporteures LysM-GFP sont utilisées comme receveuses pour des expériences sélectionnées visant à visualiser l’infiltration de neutrophiles dans les greffes pulmonaires. Les souris receveuses peuvent être imagées immédiatement après une greffe de poumon.

1. Réanesthésie les souris par administration intrapéritonéale de kétamine (80 à 100 mg / kg) et de xylazine (8 à 10 mg / kg). Administrer de la buprénorphine à libération prolongée (0,5-1,0 mg/kg) par voie sous-cutanée pour un meilleur contrôle de la douleur. Confirmez la profondeur adéquate de l’anesthésie avec un pincement de la patte.
   REMARQUE : Si le temps entre la transplantation pulmonaire et l’imagerie intravitale planifiée est inférieur à deux heures, on peut redoser l’anesthésique avec 50% de la dose initiale de kétamine.
2. Retirez les poils de toute la poitrine gauche à l’aide d’une tondeuse électrique et essuyez la poitrine pour enlever l’excès de poils coupés.
3. Appliquez une pommade ophtalmique non médicamenteuse sur les yeux de la souris pour prévenir le dessèchement de la cornée.
4. Réintuber la souris par voie orotrachéale avec un angiocathéter de 20 G, comme décrit précédemment²¹.
5. Aérer à l’air ambiant à un rythme de 120 respirations/min et un volume courant de 0,5 cc.
6. Administrer 1 % d’isofluorane par voie endotrachéale pendant toute la procédure.
7. Pour visualiser les vaisseaux sanguins pendant l’imagerie, injectez 20 μL de points quantiques non ciblés (q-dots) de 655 nm dans 50 μL de solution saline tamponnée au phosphate par voie intraveineuse au moins 5 minutes avant l’imagerie.

2. Préparation chirurgicale du poumon gauche pour l’imagerie

1. Placez la souris en position de décubitus latéral droit (voir Figure 1A).
2. Désinfectez la peau de la poitrine avec un mélange de 0,75% d’iode et de 70% d’éthanol, trois fois.
3. Rouvrir la thoracotomie gauche (issue d’une greffe de poumon de souris) par le troisième espace intercostal (voir Figure 1A).
4. Retirer une partie de la peau et des tissus mous sur le site de la thoracotomie gauche, mesurant 1,5 cm x 1,5 cm (voir la figure 1B).
5. Avant la résection des côtes, clampez d’abord les côtes pendant ~10 secondes pour thrombose toute microvascularisation afin d’obtenir une hémostase (voir Figure 1C, D).
6. Réséquez des parties de la 3^à la 5^e côte pour créer une fenêtre d’imagerie suffisamment grande pour extraire le poumon (~0,8 cm cranio-caudale et ~1,0 cm antéropostérieurement, Figure 1D, E).
7. Arrêtez tout saignement supplémentaire des bords des côtes grâce à l’électrocautérisation.
   REMARQUE : Il est essentiel d’obtenir une hémostase dans le bord coupé des côtes pour éviter une perte de sang excessive pendant la période d’imagerie.
8. Placez une petite bosse (gaze de 4 cm x 4 cm, pliée longitudinalement 3 fois) sous la poitrine droite (voir Figure 1E).
9. À l’aide de cotons-tiges, soulevez le greffon pulmonaire hors de la poitrine et placez la partie inférieure du poumon sur une bande de gaze imbibée de sérum physiologique de 1 cm x 3 cm (voir figure 1F).
   REMARQUE : Cette bande de gaze imbibée de sérum physiologique empêche le glissement du poumon, maintient un environnement humide pour le poumon, protège le poumon des bords tranchants des côtes réséquées et sépare le poumon du mouvement cardiaque. Une fois que la chambre d’imagerie circonférentielle est appliquée sur le poumon (Figure 1G, H, décrite à la section 3), il devrait y avoir une perte minimale de chaleur et de liquide de la cavité thoracique ouverte pendant la période d’imagerie.

3. Préparation de la chambre d’imagerie

REMARQUE : Une chambre d’imagerie est fabriquée sur mesure (voir Figure 2A). Cette chambre d’imagerie se compose d’une plaque de base et d’une plaque supérieure entre lesquelles la souris est placée et fixée en place à l’aide de boulons à ressort de chaque côté (Figure 2B). La plaque supérieure contient une découpe circulaire mesurant ~2 cm de diamètre. Un joint torique noir de taille correspondante est placé dans cette ouverture sur la face avant de la plaque supérieure, ce qui protégera la lentille de l’objectif (Figure 2C). Une vitre de protection de 24 mm x 50 mm est collée à l’arrière de la plaque supérieure à l’aide de graisse sous vide poussé, ce qui créera un joint étanche. Ce couvre-objet servira de fenêtre d’imagerie en adhérant au poumon situé en dessous et en maintenant le support d’imagerie (c.-à-d. l’eau) au-dessus. Assurez-vous qu’aucune graisse sous vide ne pénètre dans la fenêtre d’imagerie circulaire. Le couvre-objet sera remplacé pour chaque nouvelle expérience d’imagerie. La plaque de base est chauffée à 35-37 °C à l’aide d’une sonde de température à thermocouple (Figure 2A).

1. Placez la souris intubée sur la plaque de base de la chambre d’imagerie, la poitrine gauche ouverte vers le haut (voir Figure 1G, H). Fixez la souris avec du ruban adhésif en soie sur le visage, les pattes avant et la queue (voir Figure 1H et Figure 2A).
2. Appliquez de la colle sur la face inférieure de la vitre de protection fixée à la plaque supérieure (cercle gris sur la figure 2C, en bas), en laissant un cercle sans colle de 0,8 à 1,0 cm au centre.
   REMARQUE : Il y a un compromis entre la taille du cercle sans colle et la quantité d’artefact de mouvement ; Ainsi, il est recommandé que le cercle ne dépasse pas 1,0 cm de diamètre.
3. Abaissez la plaque supérieure jusqu’à ce que la vitre entre en contact avec le poumon, la colle touchant la surface du poumon (voir Figure 1G).
   REMARQUE : Le poumon gauche sera collé sur le couvre-objet avec un cercle propre et sans colle au milieu, qui est la zone qui sera imagée.
4. Tenez le couvre-verre contre le poumon et gonflez le poumon pendant 1 à 2 s afin que la zone de colle adhère aux tissus environnants. Réaliser le gonflage pulmonaire en obstruant le tube d’écoulement du tube endotrachéal de la souris au ventilateur.
   REMARQUE : Ne gonflez pas le poumon pendant plus de 1 à 2 secondes, car cela pourrait provoquer un barotraumatisme excessif.
5. Reculez légèrement la plaque supérieure pour réduire la pression sur le tissu pulmonaire. Assurez-vous que la zone du poumon à l’intérieur de la fenêtre d’imagerie ne bouge pas avec la ventilation.
6. Fixez les deux extrémités de la plaque supérieure en fixant l’écrou à oreilles sur chaque boulon (voir Figure 2B).

4. Imagerie à deux photons

REMARQUE : Un microscope vertical à platine fixe avec un objectif d’immersion dans l’eau à ouverture numérique (NA) 20x ou 25x >1,0 doit être utilisé pour la microscopie intravitale. Vous trouverez ci-dessous la configuration utilisée dans cette étude pour un B6 à B6. Transplantation de poumon gauche LysM-GFP avec marquage des vaisseaux sanguins à 655 nm q-dot. Lors de l’application de ce protocole, la configuration du microscope, des lasers et des filtres dichroïques peut être adaptée en fonction des besoins de l’expérience spécifique et des rapporteurs fluorescents utilisés.

1. Placez toute la chambre d’imagerie avec la souris receveuse intubée (B6 poumon gauche transplanté dans B6. LysM-GFP avec points q-points de 655 nm) sur la platine du microscope (voir Figure 2A).
2. Utilisez des filtres dichroïques de longueurs d’onde 480 nm, 560 nm et 635 nm, qui sépareront de manière appropriée les signaux du rapporteur GFP, des points q et du signal de génération de seconde harmonique (SHG) (445 nm) généré par le collagène. Ces filtres peuvent être adaptés en fonction de l’expérience spécifique.
   REMARQUE : Le signal SHG généré par le collagène délimite des structures sombres en forme de cratère, qui représentent des espaces aériens alvéolaires (voir les flèches blanches sur la figure 3).
3. Réglez le laser pulsé femtoseconde titane-saphir à 890 nm (dans la gamme du proche infrarouge) pour l’excitation. Utilisez la puissance laser la plus faible possible pour obtenir un signal suffisant.
   REMARQUE : Les paramètres du laser doivent être ajustés pour l’expérience spécifique afin de maximiser la séparation des signaux.
4. Appliquez ~1 mL d’eau pour couvrir complètement le verre de protection sur la plaque supérieure, qui sera maintenu en place par le joint torique et le joint de graisse sous vide du verre de couverture sur la plaque supérieure (voir Figure 1G et Figure 2C).
5. Utilisez l’objectif d’immersion dans l’eau 20x >1.0 NA sur le microscope. Assurez-vous que l’objectif est adapté en fonction de l’expérience spécifique.
   REMARQUE : Une NA plus grande permet une plus grande collecte de lumière, un contraste plus élevé et des images plus détaillées. Les objectifs d’immersion dans l’eau sont préférés car l’eau ou le tampon est plus compatible avec les tissus biologiques.
6. Abaissez l’objectif du microscope dans l’eau et concentrez-vous sur la surface du poumon.
7. Activez le chauffage de la plaque de base et maintenez la température à 35-37 °C.
   REMARQUE : Si l’on craint que la température des tissus ne soit maintenue ou qu’une perfusion adéquate dans les poumons soit élevée, deux résistances supplémentaires peuvent être fixées pour réchauffer la plaque supérieure en plus de la plaque de base (voir la figure supplémentaire 1).
8. Acquérez des piles d’images à l’aide du logiciel d’acquisition de votre choix.
   REMARQUE : Assurez-vous que la pièce est complètement sombre lors de l’acquisition, ce qui peut impliquer l’utilisation de rideaux/stores occultants et une couverture stratégique de toutes les sources lumineuses.

5. Acquisition vidéo

REMARQUE : Les paramètres suivants peuvent être adaptés en fonction de l’expérience spécifique. Les étapes 5.1 à 5.3 décrivent les paramètres spécifiques utilisés pour les B6 à B6. Lysm-GFP murin transplantation du poumon gauche, qui peut être utilisé comme guide de référence.

1. À l’aide d’un scanner bidirectionnel à débit vidéo, définissez les dimensions de balayage x-y sur 512 x 512 pixels.
2. À l’aide d’une unité pas à pas xyz, acquérez des enregistrements en accéléré d’une pile z de 21 étapes avec une moyenne de 10 images par étape. L’acquisition de chaque pile prend environ 20 s, ce qui comprend le temps nécessaire au calcul de la moyenne d’images, le moteur pas à pas pour se déplacer et vérifier sa position, et un délai de 100 ms.
   REMARQUE : Le scanner bidirectionnel du microscope utilisé dans cette étude fonctionne à une fréquence vidéo de 30 images/s. Cela peut différer en fonction de la configuration spécifique du microscope.
3. Acquérez 80 piles z consécutives pour obtenir une imagerie en accéléré de la migration des leucocytes dans le parenchyme tissulaire. Cela prend environ ~27 min à 20 s/pile.
   REMARQUE : La taille de la pile, la moyenne d’images, la puissance laser et la durée totale de l’enregistrement en accéléré doivent être minimisées pour éviter une exposition excessive au laser sur les tissus. Si les rapporteurs fluorescents utilisés sont brillants (c’est-à-dire GFP) et que la puissance laser est faible, la souris tolère bien la répétition d’un empilement z en 21 étapes avec une moyenne de 10 images, un balayage de 512 x 512 pixels, à des intervalles de 20 s pendant ~27 min. Si des périodes d’imagerie plus longues sont souhaitées, le temps d’acquisition par pile doit être augmenté pour maintenir l’exposition laser totale la même (c’est-à-dire 1 min par pile sur ~1,5 h). Ces paramètres devront être optimisés en fonction des rapporteurs fluorescents utilisés.
4. Euthanasier la souris à la fin de l’acquisition de l’image. Pour euthanasier, anesthésez la souris avec de la kétamine (80 à 100 mg / kg) et de la xylazine (8 à 10 mg / kg), suivie d’une luxation cervicale ultérieure. Les préparations d’imagerie typiques maintiendront facilement la viabilité de la souris jusqu’à 2 h.
   REMARQUE : Pour prolonger cette période, une supplémentation hydrique supplémentaire, une anesthésie à l’isoflurane et une attention à la régulation de la température peuvent être nécessaires.
5. Rendu vidéo complet avec Imaris. D’autres logiciels d’imagerie (tels que ImageJ) peuvent également être utilisés.
   REMARQUE : Les images peuvent être traitées après l’acquisition à l’aide de l’amélioration du contraste, du lissage et de l’arithmétique des canaux pour supprimer la diaphonie des canaux.

Résultats

Après 1 h de stockage ischémique à froid à 4 °C, nous avons transplanté orthotopiquement le poumon gauche d’une souris B6 dans une souris B6. LysM-GFP^{souris 4}, puis une imagerie intravitale à deux photons a été réalisée, comme décrit ci-dessus. Nous avons effectué l’imagerie à deux moments après la greffe - 2 h (Figure 3A) et 24 h (Figure 3B). Les vaisseaux sanguins sont marqués en rou...

Discussion

L’excitation à deux photons a été décrite pour la première fois dans sa thèse de doctorat par Maria Göppert-Mayer en 1931, qui a ensuite remporté le prix Nobel de physique pour avoir décrit la structure de la coquille nucléaire^22,23. La microscopie à fluorescence traditionnelle repose sur l’excitation d’un seul photon, avec des longueurs d’onde d’excitation plus courtes et une énergie plus élevée que les l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control