Une approche de transgenèse efficace pour l’administration de gènes dans le cœur embryonnaire de souris

Résumé

Ce protocole présente un cadre méthodologique détaillé pour la transgenèse des cellules cardiaques basée sur l’électroporation dans les cœurs de souris en développement. Les ressources vidéo fournies ici faciliteront l’apprentissage de cette technique polyvalente.

Résumé

Le cœur de mammifère est un organe complexe formé au cours du développement par des populations très diverses de cellules progénitrices. L’origine, le moment du recrutement et le destin de ces géniteurs sont essentiels au bon développement de cet organe. Les mécanismes moléculaires qui régissent la morphogenèse du cœur sont essentiels pour comprendre la pathogenèse des cardiopathies congénitales et de la régénération cardiaque embryonnaire. Les approches classiques pour étudier ces mécanismes utilisaient la génération de souris transgéniques pour évaluer la fonction de gènes spécifiques au cours du développement cardiaque. Cependant, la transgenèse chez la souris est un processus complexe et long qui ne peut souvent pas être effectué pour évaluer le rôle de gènes spécifiques au cours du développement cardiaque. Pour y remédier, nous avons développé un protocole d’électroporation et de culture efficaces de cœurs embryonnaires de souris, permettant la transgenèse transitoire pour évaluer rapidement l’effet du gain ou de la perte de fonction des gènes impliqués dans le développement cardiaque. En utilisant cette méthodologie, nous avons réussi à surexprimer Meis1 dans le cœur embryonnaire, avec une préférence pour la transfection des cellules épicardiques, démontrant ainsi les capacités de la technique.

Introduction

Le cœur est le premier organe formé au cours du développement embryonnaire. Ce processus implique la coordination spatio-temporelle de diverses populations de cellules progénitrices à partir de zones distinctes de l’embryon. Tout cela se produit pendant que le cœur en développement continue de battre et de fonctionner, mettant l’accent sur la coordination remarquable nécessaire à sa formation ^1,2,3. Compte tenu du rôle crucial du cœur, une régulation stricte aux niveaux cellulaire et moléculaire est essentielle à sa bonne formation ^4,5

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale du CNIC et conformes à la législation en vigueur, y compris la directive européenne 2010/63UE et la recommandation 2007/526/CE, telles qu’appliquées par la loi espagnole en vertu du décret royal 53/2013. Pour ce protocole, des souris CD-1 femelles de type sauvage âgées de 15 à 21 semaines ont été utilisées. Les détails concernant les animaux, les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation du plasmide et de l’outil

1. Tout d’abord, préparez le mélan....

Discussion

Dans l’ensemble, la méthodologie décrite ici offre un cadre robuste pour l’expression des constructions transgéniques dans l’épicarde en développement (Figure 4B), comme le démontre la surexpression de Meis1 (Figure 4C). Avec les constructions appropriées, ce protocole peut être utilisé pour évaluer transitoirement l’impact du gain de fonction (GOF) ou de la perte de fonction (LOF) d’un gène spécifique. Le LOF peut être implémenté dans l.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Forceps	Dumont	11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate	BD Falcon	353043
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
40 µm Cell Strainer	Fischer Scientific	08-771-1
50 mL tubes	BD Falcon	352070
70 µm Cell Strainer	Corning	CLS431751
Anti-GFP Policlonal Antibody	Invitrogen	A10262	1:1000 dilution used
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody	Invitrogen	14-6503-82	1:500 dilution used
CD1 Wild Type mice			Provided by Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signalling Technologies	9661	1:400 dilution used
DAPI	Cell Signalling Technologies	4083	1:1000 dilution used
Dispase/collagenase	Roche	10269638001
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10313021
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0	Leica	11524102
Liberase	Roche	5401119001
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	SU-P-97
pCAG expression plasmid	Addgene	#89689
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri dishes 35 × 10 mm	BD Falcon	351008
Petri dishes 60 × 15 mm	BD Falcon	353002
Phenol Red	Merck	P3532
Pipette tips			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody	Abcam	ab89901	1:300 dilution used
Square Wave Electroporator CUY21SC	Nepa Gene	CUY664-10X15
Sterile PBS			Provided and autoclaved by technical unit
Sucrose	Millipore	84100
Tweezer electrodes with variable gap	Nepa Gene	CUY650P5