Protocole optimisé pour les Swiss Rolls intestinaux et la coloration immunofluorescente des tissus inclus dans la paraffine

Résumé

L’intestin est vital pour la digestion et l’absorption. Chaque région - duodénum, jéjunum, iléon, côlon - remplit des fonctions distinctes en raison de structures cellulaires uniques. L’étude de la physiologie intestinale nécessite une analyse méticuleuse des tissus. Ce protocole décrit la fixation et le traitement des tissus à l’aide de la technique du rouleau suisse, assurant une immunocoloration précise grâce à une préservation et une orientation appropriées des tissus.

Résumé

L’intestin est un organe complexe composé de l’intestin grêle et du gros intestin. L’intestin grêle peut être divisé en duodénum, jéjunum et iléon. Chaque région anatomique de l’intestin a une fonction unique qui se reflète dans les différences de structure cellulaire. L’étude des changements dans l’intestin nécessite une analyse approfondie des différentes régions tissulaires et des altérations cellulaires. Pour étudier l’intestin et visualiser de gros morceaux de tissu, les chercheurs utilisent couramment une technique connue sous le nom de rouleaux suisses intestinaux. Dans cette technique, l’intestin est divisé en chaque région anatomique et fixé dans une orientation plate. Ensuite, le tissu est soigneusement roulé et traité pour l’enrobage de paraffine. La fixation et l’orientation correctes des tissus sont une technique de laboratoire souvent négligée, mais elles sont d’une importance cruciale pour l’analyse en aval. De plus, un mauvais roulement suisse du tissu intestinal peut endommager l’épithélium intestinal fragile, entraînant une mauvaise qualité des tissus pour l’immunocoloration. S’assurer que les tissus sont bien fixés et correctement orientés avec des structures cellulaires intactes est une étape cruciale qui garantit une visualisation optimale des cellules intestinales. Nous présentons une méthode simple et rentable pour fabriquer des rouleaux suisses afin d’inclure toutes les sections de l’intestin dans un seul bloc inclus dans la paraffine. Nous décrivons également la coloration par immunofluorescence optimisée du tissu intestinal pour étudier divers aspects de l’épithélium intestinal. Le protocole suivant fournit aux chercheurs un guide complet pour obtenir des images d’immunofluorescence de haute qualité grâce à la fixation des tissus intestinaux, à la technique du Swiss-roll et à l’immunomarquage. L’utilisation de ces approches raffinées préserve la morphologie complexe de l’épithélium intestinal et favorise une compréhension plus profonde de la physiologie et de la pathobiologie intestinales.

Introduction

L’architecture cellulaire de l’intestin pose un défi unique pour maintenir son intégrité structurelle lorsque le tissu intestinal est préservé pour l’immunomarquage. L’intestin grêle est composé de structures allongées en forme de doigts appelées villosités¹. Ces villosités se déforment souvent au cours des processus d’encastrement. Il est crucial de s’assurer que les chercheurs disposent de techniques pour intégrer correctement les intestins afin d’obtenir des coupes efficaces, permettant de visualiser toutes les régions de l’intestin, ainsi que les couches qui composent l’intestin (c’est-à-dire la musculeuse propria, la muqueuse et la séreuse....

Protocole

Le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud a approuvé tous les soins, l’entretien et le traitement des animaux. Du tissu intestinal a été prélevé sur des souris adultes C57BL/6J (mâles et femelles âgés de 3 à 5 mois, pesant environ 30 g) pour être utilisé dans la présente étude.

1. Fixation du tissu intestinal

1. Disséquez soigneusement tout l’intestin d’une souris euthanasiée et placez-le dans un bateau de pesée ou une boîte de Pétri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Retirez les intestins du PBS et utilisez des ciseaux....

Discussion

Ici, nous présentons une méthode optimisée de fixation tissulaire utilisant la technique du rouleau suisse pour préserver l’architecture intestinale et favoriser une immunocoloration précise. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour étudier une grande variété de questions de recherche impliquant la physiologie intestinale et la biologie cellulaire¹⁹. Plusieurs méthodes de laminage suisses optimisées ont été publiées et sont très utiles^{20,21<.......}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Cellulose filter paper	Cytiva	10427804	Thick Whatman paper
Charged glass slides	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Dissecting pins size 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R&D Systems	AF748
Freezer gloves	Tempshield	UX-09113-02
Heating block	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	Electron Microscopy Sciences	64111-04	Clearing reagent
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
Hydrophobic pen	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Large cassettes	Tissue-Tek	4173
Minutien pins	Fine Science Tools	NC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213	Mouse-on-mouse block
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Pressure Cooker	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Mounting medium
Reverse action forceps	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Slide Staining Set	Tissue-Tek	62540-01	Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Sodium citrate dihydrate	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Blocking buffer
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Wipes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638