Utilisation d’un test de décalage thermique pour sonder la liaison du substrat à la sélénoprotéine O

Résumé

Nous présentons ici le test de décalage thermique, une technique à haut débit basée sur la fluorescence utilisée pour étudier la liaison de petites molécules aux protéines d’intérêt.

Résumé

La définition de l’importance biologique des protéines aux fonctions inconnues constitue un obstacle important à la compréhension des processus cellulaires. Bien que les prédictions bioinformatiques et structurales aient contribué à l’étude de protéines inconnues, les validations expérimentales in vitro sont souvent entravées par les conditions optimales et les cofacteurs nécessaires à l’activité biochimique. La liaison des cofacteurs est non seulement essentielle à l’activité de certaines enzymes, mais peut également améliorer la stabilité thermique de la protéine. Une application pratique de ce phénomène consiste à utiliser le changement de stabilité thermique, mesuré par les altérations de la température de fusion de la protéine, pour sonder la liaison du ligand.

Le test de décalage thermique (TSA) peut être utilisé pour analyser la liaison de différents ligands à la protéine d’intérêt ou trouver une condition stabilisatrice pour réaliser des expériences telles que la cristallographie aux rayons X. Ici, nous décrirons un protocole pour la TSA utilisant la pseudokinase, la sélénoprotéine O (SelO), pour une méthode simple et à haut débit pour tester la liaison des métaux et des nucléotides. Contrairement aux kinases canoniques, SelO se lie à l’ATP dans une orientation inversée pour catalyser le transfert de l’AMP vers les chaînes latérales hydroxyles des protéines dans une modification post-traductionnelle connue sous le nom d’AMPylation de la protéine. En tirant parti du changement des températures de fusion, nous fournissons des informations cruciales sur les interactions moléculaires sous-jacentes à la fonction SelO.

Introduction

Une grande partie du protéome humain reste mal caractérisée. L'« effet de lumière publique » décrit par Dunham et Kustatscher et al. fait référence au phénomène où les protéines largement étudiées reçoivent plus d’attention, laissant les protéines sous-étudiées négligées ^1,2. Les facteurs contribuant à cet effet comprennent l’importance biologique et la pertinence de certaines protéines pour la maladie. De plus, les recherches antérieures qui offrent des connaissances fondamentales, ainsi que la disponibilité d’outils pour l’analyse fonctionnelle, stimulent davantage la recher....

Protocole

1. Dispositif expérimental

1. Utilisez un thermocycleur capable de détecter la fluorescence, tel qu’un instrument RT-PCR, pour exécuter le protocole décrit. Si vous utilisez SYPRO Orange, comme décrit dans ce protocole, utilisez un mode de balayage qui permet une excitation autour de 470 nm et une détection d’émission autour de 570 nm. Programmez le thermocycleur pour qu’il maintienne l’échantillon à 20 °C pendant 2 min, suivi d’une augmentation de la température de 0,5 °C/1 min jusqu’à 95 °C ; mesurer l’intensité de la fluorescence tous les 1 °C.
   REMARQUE : nous recommandons une étape facultative à la fin d....

Discussion

Le test de décalage thermique (TSA) est une méthode efficace pour cribler les interactions protéine-ligand, y compris celles avec des cofacteurs et des inhibiteurs. Dans ce protocole, nous avons utilisé la TSA pour mesurer la liaison de la pseudokinase SelO aux nucléotides et aux cations divalents. Nos résultats montrent que SelO présente une stabilité thermique accrue en présence d’ATP et de Mg²⁺/Mn²⁺. Cette observation s’aligne sur des rapports antér.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA