Évaluation de l’effet des facteurs de croissance sur la production de chlorophylles A et B à partir de microalgues

Résumé

La présente étude met en évidence les avantages de l’utilisation de la méthode développée par Jeffrey et Humphrey pour extraire et quantifier les pigments liposolubles des microalgues. Cette méthode constitue un outil précieux pour évaluer l’influence des facteurs de croissance sur la production de chlorophylle et le contenu cellulaire de ces organismes.

Résumé

Les microalgues contiennent deux grands groupes de pigments : les chlorophylles et les caroténoïdes. La chlorophylle est un pigment vert qui absorbe l’énergie lumineuse et la transforme en énergie chimique pour faciliter la synthèse des composés organiques. Ce pigment constitue une source primaire précieuse pour les intrants biotechnologiques dans les industries alimentaire, pharmaceutique et cosmétique en raison de ses propriétés antioxydantes élevées et de ses capacités colorantes. L’objectif de cette recherche était d’évaluer l’effet des facteurs de croissance (concentration en CO₂ , couleur de la lumière et intensité lumineuse) à travers un plan expérimental de Taguchi L₄ sur la croissance cellulaire et le contenu cellulaire des chlorophylles a et b chez Chlorella sorokiniana, suivi d’une validation de la méthode à l’aide d’Haematococcus pluvialis les microalgues comme modèle d’étude supplémentaire. La croissance cellulaire a été quantifiée à l’aide de la technique spectrophotométrique de densité optique à une longueur d’onde de 550 nm. Pour la quantification des chlorophylles, un extrait cellulaire a été obtenu à l’aide d’une solution d’acétone pure à 90 %, puis les concentrations de chlorophylles a et b ont été quantifiées à l’aide de techniques spectrophotométriques aux longueurs d’onde de 647 nm et 664 nm, selon la méthode décrite par Jeffrey et Humphrey. Les résultats expérimentaux ont indiqué que le contrôle des conditions de faible ajout de CO₂ , de lumière violette et de faible intensité lumineuse augmente à la fois la croissance cellulaire et la concentration de chlorophylles a et b dans les cellules. La mise en œuvre de cette méthode de quantification de la chlorophylle permet une détermination rapide, simple et précise de la teneur en chlorophylle, car les longueurs d’onde utilisées se situent aux pics d’absorbance des deux types de chlorophylles, ce qui rend cette technique facilement reproductible pour toutes les microalgues étudiées.

Introduction

Ces dernières années, les problèmes environnementaux croissants causés par les activités anthropiques et leurs effets néfastes sur la santé et l’équilibre des écosystèmes ont conduit à la recherche de systèmes de production plus efficaces et plus respectueux de l’environnement. Cela a accéléré les processus dans les industries et favorisé la mise en œuvre de traitements de biorestauration et le développement de biocomposés pour atténuer ces effets néfastes¹.

Ce contexte a conduit à un essor significatif de l’étude des microalgues, poussé par la nécessité de trouver des solutions innovantes aux défis environnementaux et économiques actuels. Les microalgues prospèrent dans les environnements aquatiques, utilisant la lumière du soleil et le dioxyde de carbone comme sources d’énergie et de carbone, respectivement. Cette caractéristique en fait une alternative durable et prometteuse pour la production de divers produits de valeur. La recherche dans ce domaine s’est concentrée sur la compréhension de la physiologie et du métabolisme de ces cellules, ainsi que sur le développement de technologies efficaces pour leur culture et leur traitement².

Il est clairement nécessaire de développer des outils accessibles et fiables pour étudier les microalgues afin d’accélérer les processus de recherche et d’approfondir la compréhension de leur physiologie, de leur métabolisme et de leurs applications potentielles. Ces outils doivent permettre d’analyser rapidement l’effet des facteurs environnementaux et de production sur des paramètres clés, tels que la concentration en chlorophylle, qui est un indicateur fondamental de la santé et du développement de ces organismes. Une diminution de la teneur en chlorophylle peut indiquer un stress environnemental, des carences nutritionnelles ou des maladies.

Ces pigments verts jouent un rôle crucial dans la photosynthèse, captant l’énergie de la lumière du soleil pour convertir le dioxyde de carbone et l’eau en glucose et en oxygène et constituent entre 0,5 % et 5 % de la biomasse des microalgues³. Au-delà de leur rôle essentiel dans le maintien des processus vitaux, les chlorophylles ont trouvé des applications dans diverses industries. Les extraits de chlorophylle sont utilisés dans la transformation des aliments et des boissons en tant que colorants naturels, conférant des teintes vertes vibrantes aux produits tout en offrant des propriétés antioxydantes. De plus, les suppléments à base de chlorophylle gagnent en popularité dans le secteur de la santé et du bien-être en raison de leurs effets détoxifiants et anti-inflammatoires présumés. En exploitant les propriétés multiformes de la chlorophylle, les industries peuvent développer des produits innovants qui contribuent à la fois à l’attrait visuel et au bien-être des consommateurs¹.

À cet égard, une microalgue d’une grande importance biotechnologique est C. sorokiniana. Ce micro-organisme se distingue par son taux de croissance rapide, ce qui le rend très efficace dans la production de biomasse. De plus, C. sorokiniana présente un contenu diversifié de composés hautement nutritionnels, notamment des protéines, des lipides et des vitamines, ce qui le rend précieux pour diverses applications dans la production d’aliments, d’aliments pour animaux et de biocarburants². De plus, on a constaté que cette espèce de microalgue produisait des enzymes extracellulaires aux fonctions diverses, ouvrant ainsi des possibilités pour des applications biotechnologiques telles que le traitement des eaux usées, la biorestauration et les produits pharmaceutiques⁴. En plus de sa croissance rapide et de ses applications polyvalentes, C. sorokiniana démontre également un potentiel important pour la production de chlorophylle. En tant que microorganisme photosynthétique, C. sorokiniana possède la machinerie nécessaire à la synthèse de la chlorophylle, qui constitue entre 0,5 % et 5 % de la biomasse des microalgues³. Cette capacité fait de C. sorokiniana un candidat attrayant pour la production de chlorophylle à l’échelle commerciale et promet d’être une solution durable aux défis environnementaux et nutritionnels urgents⁵.

D’autre part, une autre espèce de microalgues d’intérêt significatif est H. pluvialis. Cette microalgue est réputée pour sa production d’astaxanthine, un puissant pigment antioxydant ayant de nombreuses applications industrielles. L’astaxanthine sert de mécanisme de protection pour le photosystème de H. pluvialis , le protégeant du stress oxydatif induit par les facteurs environnementaux. Ce pigment est très recherché dans les industries cosmétiques, nutraceutiques et aquacoles, en raison de ses propriétés antioxydantes et de ses avantages potentiels pour la santé. Avec sa capacité abondante à produire de l’astaxanthine, H. pluvialis présente une piste prometteuse pour développer des produits innovants répondant à divers besoins industriels et de consommation⁶.

Des études récentes ont également mis en évidence le potentiel de production de chlorophylle d’Homo pluvialis¹ , ce qui renforce encore son importance industrielle. Par exemple, une étude a examiné la teneur en chlorophylle de H. pluvialis dans des conditions de croissance variables et a révélé que dans des paramètres de culture optimaux, H. pluvialis présentait des taux de production de chlorophylle remarquables, dépassant ceux des autres espèces de microalgues⁷. Cette découverte souligne le potentiel de H. pluvialis en tant que source durable de chlorophylle, offrant de nouvelles opportunités pour son utilisation dans divers secteurs industriels.

Protocole

1. Préparation du milieu de culture et préparation de l’inoculum

1. Préparez 1 L de milieu de croissance 3N-BBM+ V(CCAP) (macronutriments : NaNO₃ [0,75 g ^L-1], CaCl₂ [0,019 g ^L-1], MgSO₄ [0,019 g ^L-1], K₂HPO₄ [0,057 g ^L-1], NaCl [0,025 g ^L-1], KH₂PO₄ [0,175 g ^L-1] ; oligo-éléments : Na₂ EDTA [0,0186 g ^L-1], FeCl₃ [0,0024 g ^L-1], MnCl₂ [0,001 g ^L-1], ZnCl₂ [1,25 x ^10-4 g ^L-1], CoCl₂ [5 x ^10-5 g ^L-1], Na₂MoO₄ [9,98 x ^10-5 g ^L-1])⁸ et stérilisez-le pendant 15 min à 121 °C et 1,5 psi.
2. inoculer une fiole avec 1 L de milieu de croissance à une concentration approximative de 3 x 10⁶ cellules ^mL-1 pour la microalgue C. sorokiniana ; ou ajouter 5 % à 10 % (v/v) d’inoculum au milieu de croissance.
   REMARQUE : Pour maintenir des conditions stériles, il est recommandé d’utiliser une cagoule à flux laminaire, des gants, une blouse de laboratoire et un masque facial.
3. Incuber la fiole inoculée sous des sources de lumière rouge d’une intensité approximative de 3 600 à 4 200 lux, à une température comprise entre 22 et 26 °C, avec une photopériode de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité pour C. sorokiniana et une photopériode de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité pour H. pluvialis, et agiter manuellement toutes les 24 h, environ pendant 7 jours pour les deux souches.
   REMARQUE : Maintenir dans des conditions de croissance pendant au moins 7 à 10 jours (jusqu’à l’obtention d’une couleur vert intense) pour C. sorokiniana et 10 à 12 jours pour H. pluvialis. Pour obtenir le concentré de microalgues qui servira d’inoculum dans la cinétique, il est nécessaire d’éliminer le milieu surnageant des algues produites.
4. Dans un environnement stérile, remplir des tubes de centrifugation coniques stériles de 15 mL avec environ 10 mL de milieu inoculé et centrifuger à 3 000 x g pendant 20 min à une température de 25 à 30 °C.
5. Dans des conditions stériles, prélever le surnageant à l’aide d’une micropipette ou en versant et en concentrant la biomasse dans un tube de centrifugation conique stérile de 50 mL.
6. Répétez ce processus si nécessaire jusqu’à ce que le volume d’inoculum requis pour la cinétique soit obtenu.
7. Mesurer la densité optique (OD₅₅₀ nm) de l’inoculum pour déterminer la concentration cellulaire des microalgues et les stocker à une température de 3-4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.
   REMARQUE : Un comptage cellulaire direct a d’abord été effectué pour corréler la concentration cellulaire avec l’absorbance. Une fois compté, l’inoculum peut être conservé au réfrigérateur pendant 4 jours au maximum.

2. Etude de la cinétique de croissance

1. Préparez le volume requis de 3N-BBM+ V (CCAP) adapté à chaque expérience (8 L pour les essais au niveau du photobioréacteur pour C. sorokiniana et 0,5 L pour les essais au niveau du ballon pour H. pluvialis) conformément aux procédures de laboratoire standard, en assurant une stérilisation adéquate.
2. Pour le photobioréacteur et les flacons, configurez la source lumineuse selon le spectre de couleurs souhaité (bleu à 460 nm, violet, mélange de 460 nm et 630 nm pour C. sorokiniana et rouge à 630 nm pour H. pluvialis) ; Couvrez les deux systèmes pour éviter les interférences lumineuses externes.
   REMARQUE : En raison de la variation de la longueur d’onde émise par chaque diode électroluminescente, la spectroradiométrie a été effectuée à l’aide d’un spectroradiomètre sur les sources lumineuses pour déterminer la longueur d’onde et la puissance d’émission de chaque diode⁹. La lumière violette a été obtenue en combinant des LED rouges et bleues, ce qui a donné des longueurs d’onde de 460 nm avec une puissance d’émission de 1,65 W ^nm-1 pour les LED bleues et de 630 nm avec une puissance d’émission de 0,6 W ^nm-1 pour les LED rouges. Ces mesures ont été utilisées pour les tests effectués uniquement sous lumière bleue et rouge.
3. Programmez la minuterie pour alterner entre des cycles de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité pour C. sorokiniana et 16 h de lumière et 8 h d’obscurité pour H. pluvialis.
4. Connecter le système d’aération au CO₂ à la cuve de culture du photobioréacteur pour fournir un apport de dioxyde de carbone à des intervalles de 12 h pour C. sorokiniana.
5. Inoculer dans le récipient de culture un volume suffisant de pré-inoculum pour obtenir une densité cellulaire de départ de 3 x 10⁵ cellules ^mL-1 ou son équivalent en densité optique (DO₅₅₀ nm) = 0,180.
   REMARQUE : Assurer une technique d’asepsie pendant l’inoculation pour éviter la contamination.
6. Prélever des échantillons de culture à intervalles réguliers de 12 h pour C. sorokiniana et de 8 h pour H. pluvialis afin de surveiller la croissance cellulaire et les paramètres physiologiques. Prélever des échantillons à l’aide de techniques stériles pour maintenir l’intégrité de la culture.

3. Quantification des chlorophylles

REMARQUE : Les données pour la quantification cellulaire sont fournies dans le fichier supplémentaire 1.

1. Placez 40 ml de l’échantillon dans des tubes de centrifugation coniques en plastique.
2. Centrifuger à 3 000 x g pendant 20 min à 15 °C et jeter le surnageant par décantation ou à l’aide d’une pipette Pasteur.
3. Transférez la pastille de cellule dans un tube de verre recouvert d’une feuille d’aluminium et d’un bouchon à vis pour éviter l’oxydation.
4. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec 3 ml de solution d’acétone pure à 90 % à l’aide d’un vortex.
5. Soniquer l’échantillon en suspension dans un bain de glace pendant deux cycles de 5 min chacun et laisser reposer à 4 °C pendant 16 h¹⁰.
6. Après 16 h, le sonicate est de nouveau dans les mêmes conditions que celles mentionnées à l’étape précédente (étape 3.5) et la centrifugeuse est de nouveau dans les conditions décrites précédemment (étape 3.2).
7. Séparez l’extrait pigmentaire à l’aide d’une pipette Pasteur et transférez-le dans un autre tube propre et protégé de la lumière.
8. Placez l’extrait de pigment dans une cellule de quartz pour le lire dans un spectrophotomètre aux longueurs d’onde de 630 nm, 647 nm et 664 nm.
   REMARQUE : Calibrez le spectrophotomètre au préalable avec 90% d’acétone.
9. Pour calculer les concentrations en chlorophylle, utilisez les équations suivantes¹¹ :
   Chlorophylle a = 11,93 A₆₆₄ - 1,93 A₆₄₇
   Chlorophylle b = 20,36 A₆₄₇ - 5,50 A₆₆₄
   REMARQUE : Les résultats sont exprimés en μg ^mL-1 d’extrait, qui sont multipliés par le volume de l’extrait et divisés par le nombre de mL d’échantillon pour obtenir les concentrations de chlorophylle en μg ^mL-1 de culture.
10. Pour obtenir des valeurs en μg chl ^cell-1, utilisez la formule suivante :
    μg CHL ^cell-1 = μg CHL dans 1 mL de culture / [cellules ^mL-1] Concentration cellulaire dans la culture.

Résultats

Pour observer l’efficacité de la technique de détection des variations de la concentration cellulaire de chlorophylle et évaluer l’effet des facteurs de croissance chez C. sorokiniana, un plan expérimental Taguchi L₄ a été établi, évaluant l’ajout de volume de CO₂ , la couleur de la lumière et l’intensité de la lumière. Chaque facteur a été évalué à des niveaux faibles et élevés, comme le montre le tableau 1, dans ...

Discussion

L’étude comparative entre H. pluvialis et C. sorokiniana a révélé des différences significatives dans la dynamique de production de chlorophylle. Alors que H. pluvialis a montré une diminution de la concentration de chlorophylle tout au long de l’expérience, C. sorokiniana a montré une augmentation constante. De plus, il y avait initialement une proportion plus faible de chlorophylle a chez les deux espèces, mais ce rapport s’es...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C3H6O	Meyer	67-64-1	Acetone 90%
15 mL tube	Biologix	10-9502	Test tube
2510-DTH	Branson	D-73595	Sonicator
5 mL screw cap test tube	Kimax	45066-13100	Test tube
50 mL centrifuge tube	Biologix	10-9151	Test tube
Aluminum foil	Reynolds	611 standard, 12" x 1000 feet	Test tube cover
CaCl2	Meyer	0925-250	Calcium Chloride
Centrifuge	Dynamica	14 R	Centrifuge Refrigerated
CoCl2	Merck	1057-100	Cobalt dichloride
FeCl3	Merck	157740	Iron(III) Chloride
K2HPO4	Meyer	2051-250	Dipotassium Phosphate
KH2PO4	Meyer	2055-250	Monopotassium Phosphate
MgSO4	Meyer	1605-250	Magnesium Sulphate
Micropipette	LabNet	Model Beta-Pette	Micropipette
MnCl2	Merck	429449	Manganese(II) Chloride
Na2 EDTA	Merck	200-449-4	Edatamil, Edetato Disodium Salt Dihydrate
Na2MoO4	Merck	243655	Sodium Molybdate
NaCl	Meyer	2365-500	Sodium Chloride
NaNO3	Meyer	2465-250	Sodium Nitrate
RGB LED stripe	Steren	GAD-LED2	Light source
Spectrophotometer	PerkinElmer	Model Lambda35	Spectrophotometer
spectroradiometer	Gigahertz-Optik	model BTS256
Vortex	Scientific Industries	Vortex-Genie® 2	Vortex
ZnCl2	Merck	208086	Zinc Chloride